基因工程小鼠剖宫产生物净化技术的研究*
2021-02-10彭丽娜高则发徐汪节王朝霞
张 曼 彭丽娜 高则发 徐汪节 王朝霞
(上海交通大学实验动物中心，上海 200240)
随着生命科学、医学及实验动物科学的发展，实验动物的应用范围日益广泛，且相关技术逐渐成为生命科学与医学发展的重要支撑条件。实验小鼠是生命科学与医学研究中最为重要的模式动物之一，其质量优劣可直接反映出科学实验水平的高低。SPF级实验动物是目前国际公认的健康实验动物，用其进行科学研究可避免因疾病或病原微生物对实验结果造成的影响[1-2]。
根据国家标准《实验动物 微生物学等级及监测》14922.2-2001，2001年实验小鼠取消普通级，按其微生物学划分为清洁级、SPF级和无菌级。如何净化被微生物污染的实验小鼠以尽快提高实验动物微生物等级，成为研究较多的课题。生物净化的方式有两种：一种是剖宫产手术。医学研究表明胎盘具有屏障作用，可阻止病原微生物入侵，切断母仔纵向传播疾病。采用无菌剖宫产手术，可阻断非垂直传播病原体对仔鼠的影响，也可保持原种群的特性，是小鼠进行生物净化提高种群微生物级别最为简单、有效的途径[3-6]；另外一种生物净化方式是体外受精-胚胎移植。随着生物工程技术的发展，体外受精(IVF)和胚胎移植技术广泛应用于转基因动物、克隆动物、生物净化等诸多领域[7-8]。由于其成本高，更适用于因饲养环境、自身生理条件或年龄因素导致的雄性繁殖障碍小鼠的扩繁及品系保种或感染可通过胎盘垂直传播的病原微生物的转基因小鼠的生物净化。实验动物剖宫产代乳的净化方法在悉生动物的培育和维持中发挥重要的作用，是小动物进行生物净化维持种群微生物级别简单、经济且有效的方法。在实际工作中，上述两种生物净化方式可以相辅相成、互为补充。
因科研需要，学校每年引进的实验小鼠模型种类繁多、来源复杂且微生物等级参差不齐。为了阻止病原体通过这类小鼠传染给饲养在屏障设施内的其他动物，造成屏障内动物的污染，根据学校IACUC要求，所有微生物等级不达标的外来小鼠进入SPF级繁育房间必须经过生物净化。
本实验采用剖宫产的方式，以本中心基因工程小鼠为研究对象，进行生物净化。实验中优化实验步骤，初步探讨剖宫产技术在小鼠生物净化中的应用及提高其净化效率的方法。
1 材料和方法
1.1 主要设备与试剂
高压蒸汽灭菌器(上海一恒科技有限公司)；电热恒温水浴锅(HH-S26,金坛市大地自动化仪器厂)；生物安全柜(新加坡ESCO Class II BSC)；恒温加热台(EH20B，北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；解剖剪、解剖镊、组织剪、止血钳、医用纱布、棉签、无菌传递盒、2%过氧乙酸、1%聚洁及无菌水。
1.2 实验动物
本研究所用实验动物为饲养于上海交通大学实验动物中心屏障设施(温度：20～26℃，相对湿度：40%～70%，明暗交替12 h/12 h)，实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2018-0028，隔离检疫区隔离包内经苏州西山生物技术有限公司检测确认不符合SPF级标准，但不含有垂直传播病原体需净化的基因工程小鼠。基因工程小鼠109只，来自上海交通大学相关课题组；代乳母鼠为饲养于本中心SPF屏障内的ICR小鼠，71只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，8周龄，25～30 g，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。本实验已通过上海交通大学福利伦理审查委员会审查，编号：A2017012。
1.3 实验方法
1.3.1剖宫产时间 :待净化小鼠1∶1合笼后，次日检栓，见栓当天标记为0.5 d。从小鼠妊娠第17天开始，每天摸胎触诊，根据孕鼠子宫内胎鼠的大小和胎头的位置、羊水量、阴道口潮红充血等综合判定妊娠时间。当胎鼠的头部和躯干长度相似，且头向下，孕鼠子宫内羊水量减少，能够清晰地摸到仔鼠的四肢且阴道口充血时作为剖宫产的最佳手术时间。
1.3.2剖腹产手术:121 ℃、35 min高压灭菌。术前准备：剪刀、镊子、止血钳、灭菌纱布及医用棉签，分别配制体积为400 mL 的2%过氧乙酸消毒水和1%聚洁消毒水各一份，并放入电热恒温水浴锅内加热到37 ℃。消毒水擦拭手术操作台后，紫外灯照射时间不少于30 min，实验室紫外消毒时间不少于2 h。手术过程：在生物安全柜内采用颈椎脱臼的方法快速将待剖宫产母鼠处死后放入37 ℃、2%的过氧乙酸消毒水中浸泡8～10 s，取出置于解剖盘中，打开腹腔，暴露子宫，用无菌止血钳夹住与阴道交界处的子宫颈口，快速剪断子宫与阴道及子宫与卵巢连接处，将离体子宫先在37 ℃、1%的聚洁消毒水中浸泡3～5 s后在第二台生物安全柜内，将其转入37 ℃无菌水中洗去子宫外表面的消毒水，放于37 ℃恒温加热台的灭菌纱布上，吸干表面残留水分。钝性剥离子宫壁、卵黄囊和羊膜，取出胎鼠，然后用棉签快速将仔鼠口鼻处及身上的羊水擦拭干净，轻轻按摩心肺及四肢刺激其呼吸，待仔鼠能够自主呼吸后，剪断脐带，放入无菌转运盒中。
1.3.3代乳 :术前将代乳母鼠与仔鼠分开，将能够正常呼吸的仔鼠由无菌传递盒中转至代乳笼中，保留代乳母鼠的仔鼠2～3只，其余的全部淘汰。将代乳母鼠的尿液涂抹在剖宫产仔鼠身上或用代乳母鼠笼盒中的垫料撒在剖宫产仔鼠身上，使其沾染代乳母鼠的气味，然后将代乳母鼠放回笼盒中，并观察其代乳情况。确定代乳母鼠正常代乳后，将该母鼠所生的仔鼠全部淘汰。
1.3.4净化后小鼠微生物学检测：根据仔鼠的发育情况，21 d后离乳，并做好离乳记录。根据国标GB 14922.2—2011《实验动物 微生物学等级及监测》要求，随机从每笼剖宫产小鼠中抽取一只进行微生物检测。
2 结果
2.1 剖宫产手术开始时间对仔鼠的影响
用手指触摸胎鼠，以胎鼠头朝下、能清晰辨别出四肢且头部和躯干长度相似作为剖宫产手术开始的判断标准，记录为C；胎鼠躯体蜷曲或胎位向上时实施剖宫产手术，仔鼠带有未吸收的羊水，体质孱弱，早于标准点，记录为
表1 不同时间实施剖宫产手术对仔鼠的影响
2.2 代乳母鼠分娩后至开始代乳时间间隔对仔鼠的影响
选用分娩后不同时间间隔的母鼠进行代乳，观察并记录代乳仔鼠的成长情况，结果见表2。
表2 代乳母鼠分娩后至开始代乳不同时间的结果
2.3 剖宫产生物净化结果
对近期完成的16个品系的小鼠剖宫产手术数据分析，剖宫产手术平均成功率为(97.9±8.25)%，仔鼠的平均离乳率为(88.6%±12.7)%，见表3。
表3 剖宫产手术结果
2.4 净化后小鼠微生物学检测
净化后的小鼠在达到离乳天数时，从每窝剖宫产仔鼠中随机抽取一只送苏州西山生物技术有限公司进行SPF项目全检。结果显示，送检小鼠中均未发现SPF级动物需排除的细菌：沙门氏菌(Salmonellosisspp.)、泰泽病原体(Tyzzer organism)、支原体(Mycoplasmaspp.)、鼠棒状杆菌(Corynebacteriummurus)、嗜肺巴斯德杆菌(Pasteurellapneumotropica)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，病毒：仙台病毒(Sendai virus，SV)、鼠痘病毒(Mouse pox virus，MPV)、小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)、小鼠肺炎病毒(Pneumonia virus of mice，PVM)、呼肠孤病毒(Mouse reovirus type 3，Reo-3)及小鼠细小病毒(Mouse parvovirus，MPV)，净化后的小鼠全部符合SPF级要求。
3 讨论
小鼠因其特殊的生理特性，妊娠周期短(18.5～19.5)d，分娩前24 h是胎鼠发育的旺盛期[9-10]，故剖宫产净化中分娩期判断准确与否是手术成败的关键之一。手术时间过早，则胎鼠可能尚未发育成熟，剖出的仔鼠无法自主呼吸，而时间过晚，孕鼠可能在术前已经分娩，无法进行净化操作。
单一的阴道检栓方法很难准确判断孕鼠妊娠时间，也存在漏检和假阳性的现象，并不能准确判断小鼠的分娩时间。作为触摸胎鼠的辅助方法，根据阴道栓检出的时间，在小鼠妊娠第17天，开始触摸胎鼠，根据胎鼠的发育情况来判断孕鼠分娩时间[11]，两种方法相结合，不仅能够显著提高孕鼠分娩时间判断的准确性，而且提高剖宫产的手术成功率。触摸胎鼠需具有熟练的触诊技术，避免因操作不当对孕鼠造成应激反应或因判断不准确造成手术失败。
实验初期，经验不足，部分小鼠因基因改造或个体因素，导致胎鼠发育情况不一致，触诊时不能准确判断胎鼠发育情况。当触摸到胎鼠头部朝下时即开始手术，此时剖出的部分仔鼠带有未被吸收完全的羊水，这类仔鼠多为早产，发育不成熟，常为心肺复苏时不能自主呼吸或后期代乳时不能正常哺乳而死亡。当胎位转向后，胎鼠头部和躯干长度相似，四肢清晰可辨时进行手术，剖出的仔鼠发育成熟，心肺复苏后小鼠很快可以自主呼吸，全身呈肉粉色，代乳结束后能够正常繁殖。超过这一时期的孕鼠大都在术前自然分娩，个别小鼠因胎仔鼠少，胎儿个体过大而难产逾期，这类仔鼠如及时手术都可以成活。
另外，剖宫产手术操作时间的长短对仔鼠的成活也很重要，操作时间过长易发生仔鼠窒息或心肺复苏失败，一般从孕鼠处死到仔鼠取出时间控制在2～3 min内，心肺复苏到仔鼠可以自主呼吸控制在10～15 min。另外，新生仔鼠对温度敏感，操作需在37 ℃恒温台上完成。心肺复苏时动作要轻柔，避免因力度过大伤到仔鼠。
选择母性较好的代乳母鼠，并在手术开始前将代乳母鼠与其亲生仔鼠分开。实验中选用代乳母鼠手术前24 h内分娩的剖宫产仔鼠的窝离乳率为100%，术前分娩时间24～48 h的窝离乳率为95.65%，24 h内和24～48 h之间代乳母鼠的窝离乳率差异不显著(P>0.05)。实验中也选用了分娩48 h以上的母鼠作为代乳鼠，最长时间间隔为5 d。与前两组数据相比，可知随着分娩后时间的延长，代乳母鼠的窝离乳率降低，代乳过程中拒绝哺乳或食仔的现象增加。为提高仔鼠的成活率，代乳母鼠最好选择净化小鼠手术前0～2 d内自然分娩的为佳，最长不宜超过5 d。代乳母鼠开始代乳的第一周不换底笼，以免代乳母鼠受到惊吓而出现食仔行为。为保证剖宫产仔鼠正常发育，代乳母鼠在孕期及代乳过程中，需补充营养。本实验中为保证母鼠的营养，在代乳母鼠孕期及代乳过程中使用高繁饲料，并每周添加适量瓜子[12]。
剖宫产净化是为阻断母鼠携带的病原微生物传染给后代，以通过手术的方法提高仔鼠的微生物级别，故手术环境要求无菌。手术中所用到的器械及材料必须经过高温高压灭菌处理，手术操作台和实验室需严格消毒，为避免交叉污染，手术操作在两个生物安全柜中由不同人员合作完成，每做一例手术需更换一套无菌手术器械和器皿，且每次手术完成后都要用2%过氧乙酸对手术环境进行喷雾消毒。
综上所述，通过阴道检栓法推算剖宫产母鼠的预产期，结合触诊方法，准确判断剖宫产的时间，并优化剖宫产手术中的各个环节，显著提高剖宫产生物净化的成功率，为提高基因工程小鼠的剖宫产生物净化成功率奠定基础。
