实验动物病理组织切片质量评价体系与回顾性分析

乔 欣 李 梦 焦 昆 李胜利

(首都医科大学实验动物部，北京 100069)

病理诊断技术在实验动物相关科学研究中发挥着重要作用，是人类疾病动物模型检验、药理毒理学分析及实验动物疾病诊断中最为基本的一种形态学检验技术。病理组织切片制作则是病理诊断的基础和必要条件。病理诊断的准确性，取决于病理组织切片制作质量的高低。制片过程中，操作方法和技巧是制作出优质病理切片的前提保证。为提高病理组织切片制作效果，保证病理诊断的准确性和严谨性，对本实验动物病理室前期制作的1 800件切片质量予以分析，以期进一步改进实验动物常规切片的制作，提高病理切片制作质量。

1 材料和方法

1.1 切片选取

从本实验室两年内制作完成的病理石蜡切片中随机选取1 800件作为研究对象，根据组织切片制备质量控制评价标准对选取的病理切片进行质量评估，观察样本切片存在的质量缺陷、统计坏片率及分析导致切片出现质量缺陷的原因。

1.2 评价标准

评价标准共包括切片完整等10个方面，每个小项标准满分均为10分，满分100分。根据质量缺陷适当减分，具体见表1。评价分≥ 90 分为甲级片(优)，75～89 分为乙级片(良)，60～74 分为丙级片(基本合格)，0～59 分为丁级片(不合格)。优片率=[(甲级片+乙级片)/病理切片总件数]×100.0%，坏片率=[(基本合格+不合格)/ 病理切片总件数]×100.0%。

表1 苏木素-伊红(HE)染色切片质量的基本评价标准

2 结果

2.1 病理切片质量统计结果

在抽取研究的1 800 件病理切片中，甲级片有567 件(31.50%)，乙 级 片 有1 056件(58.67%)， 切 片 优 片 率 为 90.17%(1 623/1 800)，其余177件均存在不同程度的质量缺陷，坏片率为9.83%(177/1 800)。具体切片质量情况见表2。

表2 各级别病理切片统计结果

2.2 坏片分类及原因分析

对评估出现的177件坏片予以分析，发现导致坏片的原因多系操作不当，其中尤以取材和标本固定不当为主，试剂试药原因占比较低。出现坏片具体原因见表3。

表3 导致坏片原因

3 讨论

实验动物病理切片是兽医病理学家做出病理诊断的重要依据。切片质量优劣取决于病理切片制作过程的规范性及病理技术人员工作的严谨性，极大程度上影响病理诊断的准确性。病理切片制作过程的复杂性和繁琐环节，无论是取材、固定、脱水透明，还是浸蜡包埋、贴片、染色封片等，上述诸多环节中，任何一个节点出现问题都将对切片质量造成一定的影响。当然，病理切片出现质量错误原因既可能系操作不当，也可能是器械、试剂试药等外因所致。结合实验动物病理工作实践，对实验动物病理切片制作过程中存在的问题进行归纳、分析及总结，并提出有效的解决方法，对推进实验动物科学相关研究工作意义重大。

本研究共选取 1 800 件制作完成的病理切片，其中1 623 件符合甲、乙级切片标准，优良率为 90.17%，剩余177件均存在不同程度的质量缺陷，坏片率为9.83%。结果证明，实验室病理切片制作质量控制严格，优良率在90%以上，坏片率控制在10%以下，基本上达到了病理室技术工作要求[1]，能够满足科研需要，但切片优级率为31.5%，低于业界指标，说明制片技术仍有待于进一步提高。从统计结果看出，导致出现坏片的原因主要在于取材、标本固定、包埋切片、染色固封等环节，上述节点所致坏片比例分别为 38.42%、33.33%、15.25%和8.47%，而试剂试药原因占比较小。坏片可以发生在切片制作的任何环节。根据上述坏片原因现将处理方法总结如下：(1)规范取材。取材要尽量做到保持组织自然形态、完整性、代表性、时效性、顺序性和全面性，避免人为改变组织形态。为便于病理读片时辨认组织和识别病变，取材时应选取病变显著区与较健康区交界处和可疑病灶，组织块大小以1.5 cm × 1.0 cm × 0.5 cm为宜(不含穿刺取材)，而较大的病灶可以反映病变各阶段及病灶各层形态，故此类病灶取材时宜从中心到外周多部位顺序取材，而特殊形状器官可特殊处理。本研究涉及的因取材所致坏片中有部分系因取材不及时，组织出现了自溶，继而影响到切片质量，也有部分坏片系因所取组织块偏大，组织固定不充分而受到影响；(2)选择适合的固定液及保证充足的固定时间。固定时，固定液应新鲜，新配制的固定液最佳，避免因久放储存而影响固定效果。另外，固定液量应充足，至少为固定组织体积的5倍以上，且液面能够没过组织表面。容器大小同样非常重要，要避免强行把组织块塞入小口容器，以免损伤病理组织及固定完成后不易取出组织块。固定期间使用摇床搅动组织或晃动容器有利于固定液的渗入。鉴于实验动物病理工作涉及到的组织标本来自多种动物，且标本来源及动物年龄参差不齐，故固定要尽可能依据组织种类、性质及大小、固定液的种类、性质及渗透力、摇床转速、环境温度、实验目的等掌握最佳固定时间。如使用同种固定液，老年动物病理标本较幼龄动物标本固定时间应适当延长，小型猪或非人灵长类实验动物病理标本固定时间也要延长、小鼠标本固定时间略长。固定时间过短会导致组织结构不清晰且染色效果不佳，而固定时间过长则会导致组织过硬难以制片。目前，新型混合固定液的使用范围增大，其可以达到缩短固定时间、固定液对制片者毒性降低等效果[2]。另外，固定方式的改良，如肺脏负压固定、气管灌注固定[3]以及神经系统组织取材前，进行循环系统灌注，均可取得良好效果；(3)提升包埋与切片技巧。包埋工作对切片质量具有一定影响，需引起重视。王凤龙[4]指出，可依据环境温度选择包埋用石蜡熔点，即：熔点较高的硬蜡应在环境温度高时使用，而熔点较低的软蜡则适用于室温偏低时。组织包埋时，应考虑石蜡种类、浸蜡温度、组织块大小、石蜡硬度等因素，合理包埋。切片是制片的关键步骤。切片时，用力均匀稳定，切速缓和均一，厚度一致。切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带。切片可根据室温摸索适合蜡块的处理方法(4 ℃预冷)，避免出现刀痕，以保持组织的完整性、切片的厚度均一等。另外，及时变更刀片切点既有利于保证切片质量也利于节约，提高刀片使用时间；(4)试剂试药及时更换。存放时间过长，或其它不确定因素，均可导致试剂试药变质，继而将直接影响到切片制作中的组织脱水、透明、浸蜡等过程。严重时，还会导致污染标本，最终影响诊断。本研究出现的部分坏片，因未能及时更换变质的试剂试药所致。

总之，高质量实验动物病理切片的制备，涉及到制作过程的各个步骤，需要认真、细致及严谨。快速制作高水平切片需要长期摸索条件和改进方法，如超声波的应用极大缩短制片时间[5]。改进、提升和发展病理切片制作技术，对推进实验动物科研工作具有重要意义。