黄甲软肝颗粒对人血白蛋白致免疫性肝纤维化模型大鼠的影响

高晓新 朱春玥 张茜茜 王佳帅 曹春然 胡宇驰 李雪梅

(北京市药品检验研究院 国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206)

肝纤维化是一种继发于多种急慢性肝损伤后的自我修复机制[1]，是多种慢性肝病向肝硬化发展的必然共同病理过程[2]。现今肝纤维化的发生率逐年增加，严重威胁着人体健康和生命安全[3]。由于传统中医学诊断肝纤维化属于“积聚”、 “胁痛”、“臌胀”的病理范畴, 并无“肝纤维化”一词, 中医认为肝纤维化的基本病机为正虚血瘀, 基本证型为气阴虚损、瘀血阻络，故对此症以湿热、气血蕴结进行治疗, 疗效尤以活血化瘀类中药材和有效单体成分对肝纤维化的效果最佳[4-5]。基于中医中药的理气疏肝、活血软坚的理论，黄甲软肝颗粒用黄芪、葛根、灵芝、鳖甲、三七等中药为主要成分进行组方。本研究通过建立免疫性肝纤维化大鼠模型来检验黄甲软肝颗粒对肝纤维化的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 药物和试剂

黄甲软肝颗粒干膏粉，购自A公司，批号：HJ170206，用纯水配制浓度分别为1.44 g/mL、0.72 g/mL及0.36 g/mL；复方鳖甲软肝片，购自B厂，批号：20170604，做为阳性药用纯化水配制成浓度为0.14 g/mL；人血白蛋白(human serum albumin,HSA)，批号：L3844411 A，CSL Behring GmbH.；弗氏完全佐剂，批号：057K9904，Sigma。

1.2 实验动物

Wistar大鼠，体质量280～310 g，SPF级，雄性，72只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011，实验动物使用许可证号：SCXK(京)2015-0033。本实验已通过北京市药品检验研究院伦理审查，审查编号：ZT-2017-006。

1.3 仪器

AU400型生化仪购自OLYMPUS；XH6080 γ计数器购自西核仪厂；Typ3151准自动化化学发光仪购自Lumino。

1.4 造模

1.4.1HSA致免疫性肝纤维化大鼠模型的致敏阶段[6]：雄性Wistar大鼠72只，按体质量随机分出12只为阴性对照组动物，其余60只动物进行造模。实验第1天,大鼠腹股沟皮下注射HSA与弗氏完全佐剂等体积混合溶液;实验第14天,大鼠腹股沟皮下注射HSA与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液;实验第24天,大鼠腹股沟皮下注射HSA与1/2体积不完弗氏佐剂混合溶液;实验第34 天大鼠腹股沟皮下注射不加佐剂的HSA。每只动物的致敏剂量8 mg/mL。

1.4.2HSA致免疫性肝纤维化大鼠模型的激发阶段：末次致敏后10 d，对大鼠(除阴性对照组外)腹腔注射ALB进行激发，2次/周，共8周。激发剂量分别为：第1周，每次2.5 mg/mL；第2周，每次5 mg/mL；第3～8周，每次10 mg/mL。

1.5 分组与给药

末次激发1周后，测定造模动物血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸转移酶(AST)。根据测得的血清ALT值，将造模动物随机分为5组，即模型组、阳性药组(复方鳖甲软肝片，1.4 g/kg)、黄甲软肝高、中、低剂量组(14.4 g生药/kg、7.2 g生药/kg、3.6 g生药/kg，分别相当于临床用药剂量的2倍、1倍和0.5倍,以下简称高剂量组、中剂量组和低剂量组)。每组12只，各组给药1次/d，给药体积为1 mL/100 g，连续给药4周，模型组和阴性对照组给予同体积的纯水。

1.6 相关测定指标[7]

给药结束后，各组动物测定血清中TP、ALB、ALT和AST、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)，计算A/G比值。摘取肝脏和脾脏称质量，计算上述指数(g/100 g)。

选取相同部位肝脏制作苏木素-伊红(HE)切片，每片随机选取三个视野，分别按照如下标准记录肝纤维化病理分级，并取平均值作为该动物肝脏的病理分级依据[5]。

肝纤维化分级标准：

0级：肝脏组织结构正常，无纤维组织增生。

1级：胶原纤维从汇管区或中央静脉周围向外延伸，但未包绕整个肝小叶。

2级：胶原纤维延伸、相互连接，包绕整个肝小叶。

3级：胶原纤维包绕并分割肝小叶，以致正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大方形假小叶为主。

4级：肝小叶结构完全破坏，假小叶形成，小圆形假小叶>50%，假小叶间有粗大增生的胶原纤维。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 黄甲软肝颗粒对大鼠肝、脾质量和系数的影响

实验结果表明，模型组动物的肝、脾系数明显高于阴性对照组，差异极显著性(P<0.01)，说明HSA致大鼠肝脏形成免疫性肝纤维化造模成立。与模型组比较，黄甲软肝三个剂量组肝、脾系数呈现降低趋势，但无统计学差异(见表1)。

表1 黄甲软肝颗粒对大鼠肝、脾系数的影响

2.2 黄甲软肝颗粒对大鼠肝纤维化标志物含量的影响

大鼠血清肝纤维化标志物含量如图1所示，与阴性对照组比较，模型组大鼠血清HA、LN和Ⅳ-C含量均显著升高(P<0.01～0.05)；与模型组比较，三个剂量组血清HA的含量显著降低(P<0.01～0.05)，高剂量组血清LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量显著降低(P<0.05)。

图1 黄甲软肝颗粒对大鼠血清中HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C的影响

2.3 黄甲软肝颗粒对大鼠血清生化指标的影响

结果如图2所示，与阴性对照组比较，模型组ALT和AST显著升高(P<0.01～0.05)；与模型组比较，高剂量组血清ALT显著降低(P<0.05)，高剂量组与低剂量组血清AST显著降低(P<0.01～0.05)。

图2 黄甲软肝颗粒对大鼠血清中ALT、AST、TP、ALB及A/G的影响

2.4 黄甲软肝颗粒对大鼠肝脏组织病理学的影响

阴性对照组大鼠肝组织结构正常，模型组肝脏纤维组织增生、小叶间隔破坏、假小叶形成以及小胆管增生，病变分级(表2)较阴性对照组显著增大(P<0.01)；阳性药组、高剂量组及中剂量组肝脏纤维成分增多且呈现出由汇管区及中央静脉向外伸展、有的形成纤维间隔，但病变程度比模型组轻，病变分级与模型组比较减小，且具有统计学差异(P<0.01～0.05)。低剂量组与模型组比较，无统计学差异，但其病理组织观察显示纤维化程度有减轻的趋势。

表2 黄甲软肝颗粒对大鼠肝脏组织病理学的影响

3 讨论

各种肝损害均可引起肝细胞的坏死、再生，进一步发展为肝纤维化[8]。常用四氯化碳(CCl4)和HSA造大鼠肝纤维化模型，两模型在死亡率、血清生化及病理形态上表现大体一致，但机制各不相同[9]。与临床肝纤维化机制相似，HSA模型为Ⅲ型变态反应，主要在肝门脉汇管区形成免疫复合物沉积，从而引起局部炎症反应，进一步刺激胶原增生而造成肝纤维化[10-11]。此模型主要表现为血清TP、ALT、AST、HA和PCⅢ水平升高，ALB、A/G及Ⅳ型胶原-C水平下降，肝、脾脏指数上升。

纤维化的病因和表型不同，治疗策略也不同[12]；联合用药在临床研究中显示出了高效低毒的优势[13]。中医理论认为肝纤维化是气阴虚损、瘀血阻络所致，从“瘀”与“虚”方面探索发现中医药在抗肝纤维化方面有着明显的优势[14]。有研究发现，黄芪、 黄芪总皂苷及黄芪甲苷具有降低肝纤维化大鼠肝功指标和组织病理损伤的作用[15-18]，葛根素也具有一定的抗肝纤维化作用[19-20]。基于研究和中医理论组方黄甲软肝颗粒，主要成分为黄芪、葛根、三七、灵芝、鳖甲等。

实验结果显示，黄甲软肝三个剂量组均能明显降低血清HA的含量，高剂量能明显降低血清LN、ALT、AST含量及PCⅢ的水平;高、低剂量组能显著降低血清AST含量；高、中剂量组明显减轻模型大鼠肝脏纤维化病理形态改变。综上所述，本实验证实黄甲软肝颗粒对大鼠HSA致免疫性肝纤维化有一定的疗效，为其临床使用提供依据。