17β-雌二醇对人成骨肉瘤细胞CLCF1 基因表达的影响

（福建省中医药科学院基础研究室，福建 福州 350003）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal Osteoporosis，PMOP）是一种与衰老有关的常见病，主要发生在绝经后妇女，是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，导致骨脆性增加，易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。研究显示，绝经后骨质疏松症以肾阴虚为主[1，2]。前期研究发现[1]，CLCF1 是PMOP 肾阴虚证的关联基因，CLCF1 在PMOP 肾阴虚证组的表达水平明显低于健康对照组，但其失调的原因尚未可知。女性绝经后雌激素水平下降，骨偶联过程失调，这是PMOP 发生的主要原因[3]。雌激素在维持骨代谢动态平衡方面扮演着非常重要的角色，PMOP 肾阴虚证患者雌激素水平对CLCF1 基因表达是否有影响，目前尚未见报道。因此本研究通过体外观察17β-雌二醇对MG-63 细胞CLCF1 表达的影响，旨在揭示CLCF1 基因在PMOP 肾阴虚证的表达调控机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 本实验于2019 年4 月～2020 年8月在福建省中医药科学院完成。人骨肉瘤细胞MG-63 购自中国科学院上海细胞库，主要试剂包括无酚红a-MEM 培养基（Thermo fisher 公司）、胰酶（Hyclone 公司）、胎牛血清FBS、牛血清白蛋白BSA（Sigma 公司）、17β-雌二醇（MCE）、雌激素受体抑制剂氟维司群（MCE 公司）、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega 公司）。主要仪器涉及酶标仪（Tecan 公司，Infinite M1000），实时荧光定量PCR 仪（ABI 公司，7500 FAST）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 复苏冻存的MG-63 细胞，培养液为10%的无酚红a-MEM 培养基，按105 细胞量接种于6 孔板中，于37℃，5%CO2条件下培养。24 h 后改用0.1% BSA 的无血清培养3 h 使细胞同步化。

1.2.2 干预实验 将骨肉瘤细胞MG-63 分为对照组、β-雌二醇低、中、高剂量组。对照组加入10-3mol/L DMSO，将17β-雌二醇用DMSO 稀释后，分别加入β-雌二醇低、中、高剂量组，终浓度分别为10-10、10-9、10-8mol/L。干预24、48、72 h 分别后消化细胞，采用ABI 7500 Real time PCR 检测样本中mRNA 的表达情况。用2-△△Ct法分析基因的表达情况。

1.2.3 构建载体及转染 PCR 扩增目的基因CLCF1，酶切pGL3-basic 质粒后，回收载体片段。将目的基因与载体片段同源重组后，转化大肠杆菌感受态细胞。用菌落PCR 鉴定转化子，筛选出阳性克隆，送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。将MG63 细胞接种到6 孔板，12 h 后转染。分别加入10-3mol/L DMSO，10-8mol/L 17β，10-8mol/L 17β-雌二醇+10-7mol/L 雌激素受体抑制剂ICI。

1.2.4 双荧光素酶活性检测 转染24 h 后，弃去培养基，用PBS 清洗后，每孔加入300 μl 的PLB 细胞裂解液，室温振摇15 min 使之裂解。在96 孔板中每孔加20 μl 预先混好的Luciferase Assay ReagentⅡ，再加入细胞裂解液上清30 μl，2 s 后测数据。之后立即加入20 μl 终止反应试剂，静止2 s 后，用酶标仪进行荧光素酶活性检测。

1.3 统计学分析 数据采用SPSS 19.0 统计软件进行分析，计量资料用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，当方差齐时，选用LSD-t 检验，当方差不齐时，选用秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组CLCF1 基因表达比较 荧光定量PCR 显示，干预24 h 后，β-雌二醇低、中、高剂量组CLCF1的表达分别是对照组的8.21 倍、9.67 倍、10.07 倍，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。干预48 h 后，β-雌二醇低、中、高剂量组CLCF1 的表达分别是对照组的0.93 倍、1.26 倍、2.1 倍，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2；干预72 h 后，β-雌二醇低、中、高剂量组CLCF1 的表达分别是对照组的0.48 倍、0.95倍、1.38 倍，见图3，其中β-雌二醇低剂量组与对照组比较，表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），β-雌二醇中、高剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

图1 干预24 h 各组CLCF1 基因表达比较

图2 干预48 h 各组CLCF1 基因表达比较

图3 干预72 h 各组CLCF1 基因表达比较

表1 各组CLCF1 基因表达比较（）

表1 各组CLCF1 基因表达比较（）

2.2 转染后荧光素酶活性比较 与对照组相比，17β-雌二醇高剂量组荧光素酶活性提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；加入雌激素受体抑制剂ICI 后，荧光素酶活性较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图4。

表2 转染后荧光素酶活性（）

表2 转染后荧光素酶活性（）

图4 转染后荧光素酶活性

3 讨论

绝经后骨质疏松症是老年常见多发病。女性绝经后卵巢功能衰退，雌激素水平下降，目前研究证实雌激素可通过多条信号通路影响骨骼的生长和重构，如MEK/ERK 信号通路[4]、NF-κB 信号通路[5]、FasL 信号通路[6]等，其作用机制复杂，且内在机理尚未完全阐明。前期研究发现CLCF1 是PMOP 肾阴虚证的关联基因，PMOP 肾阴虚证组CLCF1 表达水平明显降低。PMOP 肾阴虚证患者雌激素和CLCF1 水平同时降低，然而关于雌激素和CLCF1 之间的关系报道较少。

本研究显示，分别用10-10、10-9、10-8mol/L 17β-雌二醇干预MG63 细胞24 h 后，CLCF1 的表达分别是对照组的8.21 倍、9.67 倍、10.07 倍，说明三个浓度均能促进CLCF1 的表达，且随着浓度上升，CLCF1 表达呈剂量依赖性，以10-8mol/L 17β-雌二醇促进作用最明显；干预48h 后，加入10-10、10-9、10-8mol/L 17β-雌二醇的MG63 细胞CLCF1 的表达分别是对照组的0.93 倍、1.26 倍、2.1 倍，其中10-8mol/L 17β-雌二醇可以促进CLCF1 基因的表达，但与24 h 相比，促进作用已经减弱；干预72 h后，低、中、高三个剂量组CLCF1 的表达分别是对照组的0.48 倍、0.95 倍、1.38 倍，其中β-雌二醇低剂量组与对照组比较，表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），β-雌二醇中、高剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明17β-雌二醇作用72 h后，对CLCF1 基因已经没有促进作用，甚至出现了抑制作用。因此可以确定筛出最佳条件：10-8mol/L 17β-雌二醇作用MG63 细胞24 h，对CLCF1 基因表达的促进作用最高。本研究还显示，10-8mol/L 17β-雌二醇组荧光素酶活性高于对照组，说明17β-雌二醇可以提高CLCF1 基因的启动子活性；当17β-雌二醇加上雌激素受体抑制剂后，荧光素酶活性降低，推断雌激素受体抑制剂与17β-雌二醇联合作用可阻断17β-雌二醇的作用，进一步验证了17β-雌二醇可以提高CLCF1 基因的启动子活性。

CLCF1 为重组心肌营养素样细胞因子1 基因表达的蛋白，是糖蛋白（gp）130 因子家族成员之一，是一种强效神经营养因子、B 细胞刺激因子。它主要存在于淋巴结和脾脏。CLCF1 可通过gp130 受体刺激B 细胞活化，参与体液免疫，是人体免疫方面的重要基因[7，8]。课题组前期研究发现，CLCF1 可通过调控JAK2/STAT3 蛋白、磷酸化水平，达到调控骨代谢的目的[9]。JAK2/STAT3 信号通路广泛参与细胞增殖、分化以及免疫调节等，是众多细胞因子信号转导的重要途径，参与多种细胞因子对骨代谢的调节[10-12]。有研究[13，14]表明JAK2/STAT3 信号通路可能是细胞因子调控RANKL 诱导破骨细胞分化重要的分子途径，雌激素可以激活JAK2/STAT3 信号通路。鉴于CLCF1 和雌激素都可以激活JAK2/STAT3 信号通路，本研究证实17β-雌二醇可以促进CLCF1 基因的表达，故推测17β-雌二醇可能通过CLCF1 激活JAK2/STAT3 通路，达到调控骨代谢的目的，这可能也是骨质疏松症肾阴虚证的分子机制之一。但是17β-雌二醇如何调控CLCF1 基因的表达，进而调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证，还需要进一步证实。

综上所述，17β-雌二醇可通过提高CLCF1 启动子活性促进MG63 细胞株CLCF1 基因的表达，这可能是绝经后骨质疏松症肾阴虚证的分子机制之一。