不同不育类型患者精液质量比较及对补救卵胞浆内单精子注射术临床结局的影响分析

陈其桂，李大文，成俊萍，薛林涛，谭卫红，李金燕，何泳志，黄泰帅

不孕不育症是全球性难题，据估计，全球有多达1.86亿人受其影响，虽可通过不同的助孕技术使不孕不育夫妇获得生殖机会，但助孕结局不理想等问题依然存在[1]。在体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)助孕中，不可避免地会遇到受精失败的发生。据研究报道，IVF的平均受精率为70%～80%[2]，受精失败发生率约为10%[3]，导致可移植胚胎减少，甚至周期取消。受精失败的原因可能与精卵质量、精卵识别、结合异常及体外环境因素影响等有关。补救卵胞浆内单精子注射术(rescue intracytoplasmic sperm injection，R-ICSI)是IVF-ET失败后的挽救方案，目前已广泛应用于IVF完全受精失败或低受精的不孕不育患者[4]。但是，R-ICSI也存在受精率、临床妊娠率不高等问题[5]。目前，有部分学者对精子正常形态率、精子顶体完整率、顶体反应率、精子DNA断裂指数(DNA fragmentation index,DFI)与R-ICSI结局相关性进行了报道[6，7]，但关于不同不育类型对R-ICSI结局影响的研究仍鲜见报道。不育类型可根据既往妊娠情况分为原发性不育和继发性不育，然而辅助生殖技术治疗往往只是依据男性精液质量或女性卵巢、输卵管功能及性激素水平进行，对患者的临床诊断关注较少。鉴此，本文通过回顾性研究探讨不同不育类型患者精液质量情况及其对R-ICSI结局的影响，旨在为临床生殖医师的诊疗工作提供理论依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性研究2014-01～2018-12于广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心行常规IVF-ET失败而进行R-ICSI治疗的98对不孕不育夫妇的临床资料。根据不育类型将98对夫妇分为原发性不育组(n=56)和继发性不育组(n=42)。原发性不育指男子从未使女性受孕；继发性不育指男子有使女性受孕史[8]。纳入标准：(1)女性年龄<38岁；(2)夫妇双方染色体检查正常；(3)精子来源均为丈夫，手淫法获得；(4)女方体质量指数(Body Mass Index,BMI)在正常范围(18.5～23.9 kg/m2)；(5)超促排卵用药方案为长方案；(6)女方均为单纯输卵管因素导致不孕。排除标准：(1)夫妇双方生殖器发育异常、生殖系统感染及男性性功能障碍等；(2)男方吸烟、酗酒及服用影响精子活力的药物；(3)女方有子宫腺肌症、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征等疾病。

1.2治疗方法

1.2.1 促排卵及采卵 采用促性腺激素激动剂(达菲林，益普生公司)、促卵泡生成素(果纳芬，瑞士雪兰诺)，和(或)人绝经期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG，丽珠制药)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG，瑞士雪兰诺)长方案超促排卵。自用促性腺激素4 d后开始B超监测卵泡发育，当有2个卵泡直径>18 mm时，于当晚21:00左右予HCG 10 000 IU肌肉注射，给药36 h于手术室在阴道B超引导下行经阴道超声穿刺取卵。

1.2.2 精液采集 男性患者禁欲2～7 d，采用手淫法取精液置于干燥消毒量杯内，标本被转送到实验室过程中，应保持在20～37 ℃，置于37 ℃恒温箱内液化。

1.2.3 R-ICSI适应证及治疗 以第二极体作为早期受精的判断标准，受精6 h观察，若患者所有成熟卵母细胞中出现明确第二极体的比例<30%，建议行R-ICSI，并与患者签署R-ICSI知情同意书。对IVF周期中未排出第二极体的卵母细胞于受精6～8 h后再次观察，如仍未排出第二极体，于当晚行R-ICSI，即使用显微操作设备挑选单个精子注入未排出第二极体的成熟卵母细胞胞质内。注射后16～18 h观察受精情况，48 h观察卵裂情况，48～72 h选取优质胚胎由生殖医师进行移植。

1.3观察指标

1.3.1 一般临床情况 包括年龄、BMI、不育年限等。

1.3.2 基础促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平检测 于月经周期第3～5天抽静脉血(患者空腹),采用ADVIA Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂(美国)对基础FSH、LH进行检测，操作过程严格按照说明书进行。

1.3.3 HCG日子宫内膜厚度检测 患者取仰卧位,采用迈瑞DC-6、西门子ACUSON Antares彩色超声诊断仪(阴道超声探头频率5.0～9.0 MHz)对子宫进行多切面扫查，取子宫正中矢状纵切面，在垂直于宫腔线的方向测量子宫中央两条外侧腔回声线之间的厚度，即子宫内膜厚度。

1.3.4 精液常规检测 通过称重收集量器中的精液来测量精液体积；使用计算机精子辅助分析(CASA)系统测定精子浓度、精子总数及前向运动精子百分率。检测方法:全份精液标本液化后取20 μl样品于一次性精液常规分析玻片上，精液常规分析严格按照世界卫生组织(World Health Organization，WHO)技术规范进行操作，采用精子动态图像自动检测系统检测标本，每份标本随机采样>200个精子，获得精子浓度、精子总数及前向运动精子百分率等参数，每份标本均在3～5 min内完成检测。前向运动评估：精子主动地呈直线或沿一大圆周运动，不管其速度如何。参考值：精液体积≥1.5 ml；精子浓度≥15×106/ml；一次射精精子总数≥39×106/ml；前向运动精子≥32%[9]。

1.3.5 精子正常形态率检测 采用WHO推荐的Diff-Quik快速染色方法进行精液涂片染色[9]。评估精子形态时采用严格标准：精子头外形上应是光滑、轮廓规则，大体上呈椭圆形，顶体区可清晰分辨，占头部40%～70%，顶体区无大空泡，且不超过2个小空泡，空泡大小不超过头部20%，顶体后区不含任何空泡；中段应细长、规则，大约与头部长度相等，中段主轴应与头部长轴成一条直线；主段应比中段细，均一，其长约45 μm(约为头部长度的10倍)，尾部应没有显示鞭毛折断的锐利折角。只有精子头、颈、中段和尾部均正常的精子才认为是正常精子。至少计数200个精子，确定正常精子形态率。

1.3.6 精子顶体完整率及自发顶体反应率检测 采用豌豆凝集素(pisum sativum agglutinin,PSA)荧光染色法进行检测(试剂盒购自Sigma Chem Co公司),并以异硫氰酸荧光素标记。操作方法：使用密度梯度离心法+上游法处理液化好的精液，取10 μl精子悬液均匀涂抹在干净的载玻片上，自然干燥后置于95%乙醇中固定30 min，再次干燥完毕后置于PSA工作液中，4 ℃避光反应8～12 h，反应结束后取出玻片，用去离子水轻微冲洗、干燥并避光保存，荧光显微镜450～490 nm激发光下油镜观察涂片。判读标准严格参考试剂盒说明书进行，判定方法：正常精子顶体在荧光显微镜下有一致且明亮的荧光，顶体区域占精子头部40%～70%；异常精子顶体无完整的帽状半球型荧光，或着色不均匀呈大头、尖头样，或顶体中有空泡，以上皆可认为属于顶体不完整。其中仅精子头部赤道板附近有明亮带状荧光者属于发生自发反应后的顶体。见图1。计算方法：利用血细胞计数器计数400条以上精子，统计顶体完整精子数、顶体不完整精子数以及自发顶体发生数。顶体完整率=顶体完整精子总数/检测精子总数×100%，自发顶体反应率=自发顶体发生数/检测精子总数×100%。

图1 精子顶体图(×400，油镜)

1.3.7 精子DFI检测 采用精子染色质扩散试验进行检测，染色试剂为瑞氏-姬姆萨(珠海贝索生物技术有限公司)。精子DNA完整性检测试剂盒购自西班牙halotech Dna sl公司。计算方法：使用400倍显微镜，配合血细胞计数器进行人工判别，计数200条以上精子。判读标准严格参考试剂盒说明书进行，按照染色晕圈直径与精子核直径的比值大小将精子晕圈分为5个等级：1级，大晕圈(>1)；2级，中等晕圈(1/3～1)；3级，小晕圈(<1/3)；4级，无晕圈；5级，精子头部不着色。200条以上精子计数完毕后计算出每个等级的百分比，其中DFI为3、4、5等级百分比之和。

1.3.8 受精率、卵裂率、优胚率及临床结局观察 R-ICSI治疗后第1天观察卵母细胞受精情况，以双原核(2PN)卵子作为正常受精卵。受精后培养3 d后观察胚胎状况，主要从胚胎的卵裂球数目、卵裂球的均一性及胚胎碎片这三个方面进行评估。一般情况下，受精后第3天卵裂球数目应达到7～9个细胞，对于第3天时卵裂球数目达到7～9个的胚胎，评为优质胚胎。卵裂球均一性及胚胎碎片分为4个等级:Ⅰ级：卵裂球大小均匀，胞质均匀清晰，碎片少(≤5%)；Ⅱ级：卵裂球大小略不均匀，形态略不规则，有少量碎片(6%～20%)；Ⅲ级：卵裂球大小不均匀，有明显的形态不规则，较多碎片(21%～50%)；Ⅳ级：卵裂球大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象，大量碎片(>50%)。其中Ⅰ、Ⅱ级胚胎评为优质胚胎。本研究优质胚胎评估标准为卵裂球数目达到7～9个的胚胎以及Ⅰ、Ⅱ级胚胎。生殖医师选择优质胚胎进行移植，移植胚胎数≤3个，剩余Ⅲ级以上胚胎予冷冻保存，并给予黄体支持。移植术后第14天测血β-HCG水平，若阳性则确定妊娠。若妊娠，则分别于第28天、第42天行B超检查了解胚胎发育情况，若B超见宫腔内孕囊及心管搏动则确立临床妊娠。黄体支持自妊娠8周起逐渐减量至妊娠10周停用,随访至妊娠12周转入产科门诊建档立卡及定期产检。我科进行电话随访记录最终结局。指标计算方法：受精率=受精卵母细胞数/卵母细胞数×100%；卵裂率=卵裂数/受精卵母细胞数×100%；优胚率=优质胚胎数/卵裂数×100%；临床妊娠率=临床妊娠例数/移植周期例数×100%；活产率=活婴分娩数/移植周期例数×100%；早产率=早产例数/临床妊娠例数×100%；流产率=流产例数/临床妊娠例数×100%；单胎率=单胎例数/临床妊娠例数×100%；双胎率=双胎例数/临床妊娠例数×100%。

2 结果

2.1两组一般情况比较 两组患者女方年龄及获卵数的比较差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者不育年限、男方年龄、女方BMI、基础FSH值、基础LH值、窦卵泡数、HCG日子宫内膜厚度方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般情况比较

2.2两组精液质量比较 继发性不育组前向运动精子百分率大于原发性不育组，精子DFI小于原发性不育组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。但两组患者在精液体积、精子浓度、精子总数、精子正常形态率、精子顶体完整率及精子自发顶体反应率方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组精液质量比较

2.3两组胚胎发育情况及临床结局比较 两组患者临床妊娠率比较差异有统计学意义(P<0.05)。另外，两组患者受精率、卵裂率、优胚率、活产率、早产率、流产率、单胎率及双胎率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组胚胎发育情况及临床结局比较[n(%)]

3 讨论

3.1不育症可对男性生殖健康造成重大影响，近年来，不育症发病率逐年增加，原发性不育的发生率大于继发性不育[10]，这除了男性自身机体内分泌紊乱外，体外环境也占据了一大部分原因。近十几年来，男性精液质量呈现明显下降情况，这与男性不育关系密切。男性精子受精能力可通过精液参数表现，精液分析是评估不育症的重要方法。另外，男科医师可结合精液质量检测结果与患者的不同不育类型而合理地选择治疗方案。目前，关于不育类型与精液质量的研究结论不一。成洁和赵君利[11]的研究结果显示，继发性不育者的精子活力显著优于原发性不育者。杨东等[12]的研究显示，原发性不育患者的精子活力异常情况更为常见。王军和吕红蕾[13]认为精子质量欠佳是导致原发性不育的主要原因。但是，Gowri等[14]的研究结果显示，原发性不育与继发性不育症患者精液参数评价差异无显著性。本研究通过比较原发性不育与继发性不育的精液质量，发现继发性不育组前向运动精子百分率大于原发性不育组，精子DFI小于原发性不育组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。但两组患者在精液体积、精子浓度、精子总数、精子正常形态率、精子顶体完整率及精子自发顶体反应率方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)，提示原发性不育男性的精液质量劣于继发性不育患者。而这可能与原发性不育患者承受更大的心理、精神及社会压力有关[15]。生育力是男性雄性魅力的体现，原发性不育患者对此则更为敏感，自我价值评价下降，这种慢性的不良应激会影响精子发育、成熟，导致精液质量的下降。上述结果提示临床医师在行R-ICSI治疗前，应注重原发性不育者精液质量检测及诊疗，适当予以心理疏导，缓解患者焦虑情绪。

3.2虽然目前IVF技术逐渐成熟，但仍不能达到100%的受精成功率。胚胎室技术人员可采用对IVF授精后6 h去除卵丘细胞方法初步观察卵子受精情况，从而决定是否进行R-ICSI治疗。Xiong等[16]研究指出该方案是安全有效的，有利于早期观察受精情况。王雪莹等[17]认为IVF受精失败及受精率低下的患者可通过早期行R-ICSI治疗，从而优化妊娠结局。关于不孕不育类型对辅助生殖助孕结局的影响，有研究[18，19]指出，原发不孕不育者常规IVF受精失败率较高，建议采用短时受精结合R-ICSI方法优化临床结局。施晓鋆等[20]则强调R-ICSI应积极应用于不孕年限长且IVF反复失败的原发性不孕者。但是，陈大霞和雷小敏[21]的研究认为受精障碍并不归因于原发性不孕。本文则进一步研究了不育类型对R-ICSI结局的影响，结果发现，原发性不育组女方年龄较继发性不育组小，获卵数较继发性不育组多。在R-ICSI结局上，原发性不育组临床妊娠率高于继发性不育组，但两组的胚胎发育情况及其余临床结局无显著差异。虽然原发性不育组精液质量较继发性不育组稍差，但是临床妊娠率却比继发性不育组高。分析可能是由于两组间女方年龄差异导致，继发性不育组女方年龄较大，随着女方年龄增大，可获得卵泡数减少，非整倍体染色体数目增多，卵子生长环境发生改变，卵母细胞质量降低，卵巢功能减退，子宫内膜变薄，从而不利于临床结局[22]。据研究报道[23]，女性年龄与卵母细胞质量呈负相关，影响妊娠成功率。也可能是由于卵母细胞对精子DNA损伤具有修复作用，而女性年龄影响卵母细胞质量，质量较高的卵母细胞具备更优的DNA修复能力[24]，这也使得两组间精液质量的差异并不会很大程度地影响R-ICSI结局，同时这也造成了研究偏倚。另外，由于R-ICSI是人为挑选高质量的精子行助孕治疗，使一条精子受精成为可能，降低了精液质量对妊娠结果的影响。本研究结果显示，两组女方患者基础性激素、窦卵泡数无显著差异，且研究对象均采用常规长方案超促排卵，并严格按照纳入及排除标准进行筛选。这排除了内分泌异常、卵巢储备功能异常及不同促排卵方案对结局造成的影响，故该研究虽然存在一定偏倚，但结果、结论仍具有较高的可信度。

综上所述，本研究通过回顾性研究比较不同不育类型患者的精液质量情况及其对R-ICSI临床结局的影响，发现不同的不育类型患者精液质量存在差异，且其可对R-ICSI临床妊娠率产生影响。这提示临床医师在R-ICSI助孕方案中，应注意不同不育类型的影响以制定详细规范的诊疗方案。