母代高脂饮食对雄性后代小鼠青春期后期运动能力及学习记忆行为的影响*

张太花

（青海省妇女儿童医院，青海西宁810007）

在过去的几十年里，肥胖发生率在世界范围内急剧上升，甚至已经达到流行病的程度［1］。肥胖是多种代谢性疾病的根源，现在的研究表明，肥胖和营养不良，心血管疾病，糖尿病具有显著相关性［2］。近些年，营养过剩导致的肥胖已取代营养不良成为我国主要的营养健康问题［3］。高脂肪高能量饮食结构可提高肥胖和代谢性疾病发生率，同时女性围产期肥胖或高脂饮食摄入可增加子代肥胖和代谢紊乱发生的风险［4］。胎儿暴露于高血脂水平的子宫环境中可引起自身大脑发育和代谢功能的重要改变［5］，女性围产期肥胖对子代运动能力和学习记忆行为的损伤机制研究并不十分充分。

本实验主要通过高脂饮食（high-fat diet，HFD）喂养母鼠16 周建立母鼠肥胖模型，通过转棒实验，旷场实验研究了雄性子代小鼠运动能力的变化，通过水迷宫、新物体识别等实验研究了子代小鼠学习记忆行为的改变，最后我们通过免疫荧光实验观察了子代小鼠海马齿状回（dentate gyrus，DG）神经元的分化和结构变化。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF 级 C57BL/6J 母鼠 24 只和雄鼠 8 只购自南京模式生物，实验动物生产许可证号为SCXK（苏）2018-0002，动物质量合格证号为No.0016432。所有小鼠饲养在SPF 级动物房中，可自由进食进水，动物房室温（22±1）℃，昼夜循环12 h。母鼠被随机分为标准（脂肪含量为15%）饮食组（control 组）和高脂（脂肪含量58%）饮食组（HFD 组）。母鼠高脂饮食或标准喂养16 周建立肥胖模型，随后每3 只母鼠与1只雄性同笼交配，雄性小鼠断奶后与母鼠分离并正常饮食饲养至5 周龄进行相关动物学实验，每组13只。本研究中所有动物实验均通过青海省妇女儿童医院伦理委员会审查并遵从动物福利3R原则。

2 主要试剂与仪器信息

BrdU、鼠抗DCX 抗体和鼠抗BrdU 抗体（Sigma）；荧光Ⅱ抗（Thermo Fisher）。主要仪器包括转棒测试仪、旷场实验、水迷宫测试装置。旷场实验及水迷宫测试所用设备为实验室自制；监测系统及分析软件购自Noldus。

3 方法

3.1 小鼠脑组织分离及切片 在行为学实验结束后取小鼠脑组织。戊巴比妥钠麻醉小鼠，断颈后快速取出完整脑组织，置于4%多聚甲醛中固定过夜。第2 天开始在4℃下分别在20%和30%蔗糖溶液中依次脱水过夜。使用冷冻切片机连续切割获得小鼠海马切片，保存在-80℃下。

3.2 免疫荧光实验 BrdU（100 mg/kg）通过腹腔注射至小鼠体内，第1 次注射后每2 h 注射1 次，共5次，注射完毕后3 周处死小鼠，取材并进行后续实验。将脑片置于PBS 中洗涤3 次后，采用0.3% Triton 溶液处理30 min，随后用山羊血清在37℃下封闭1 h。室温孵育Ⅰ抗（抗DCX抗体1∶1 000，抗BrdU抗体1∶1 500）1 h 后4℃过夜。第2 天洗去Ⅰ抗后滴加荧光Ⅱ抗（1∶500）并室温孵育1 h。随机选取3 个视野，通过ImageJ软件分析。

3.3 转棒实验 小鼠在转棒疲劳机上训练2 d，每天2次，每次次训练5 min，转棒匀速从8 r/min开始后以4 r/d的增速递增至20 r/min。随后进行连续3 d的测试，转棒仪速度设置为20 r/min，记录小鼠掉落的时间。

3.4 足迹分析 将小鼠放置在平板玻璃跑道上面，引诱动物从跑道一端行走到另一端，同时在跑道下面使用高速摄像机对动物足迹进行录像。通过对动物行走足迹视频的分析，即可获得动物步态的各个参数。

3.5 旷场实验 小鼠在旷场所在实验室适应1 h后，分别放入旷场中，记录5 min 的自发活动，末只小鼠行为结束后使用75%乙醇清洁旷场地板。使用Noldus 软件记录和分析小鼠运动总距离和中央区域运动距离。由对分组不知情的其他专业实验人员来分析小鼠站立情况。

3.6 水迷宫实验 将小鼠放入随机四个象限之一作为起始象限，记录动物找到水下平台的时间。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔15～20 min，连续训练5 d。最后一次训练结束后的第2 天，将平台撤除，开始1 min 的探查训练。将动物从原先平台所在位置的对侧象限放入水中，记录动物在目标象限所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

3.7 十字高架迷宫实验 小鼠在十字高架迷宫所在实验室适应1 h 后，分别进行十字高架迷宫实验。开始时，将小鼠放入迷宫闭合臂中，记录5 min 小鼠的活动后进行相关分析。

3.8 新物体识别实验 第1 天将小鼠放入场地适应10 min。第2 天，在场地中放入2 个完全相同的A物体，记录放入小鼠之后小鼠与这两个物体接触的情况。第3 天，将场地内的其中一个物体换作B 物体，观察小鼠5 min 内对两个物体的探究情况。统计小鼠探索A 和B 物体的时间，计算Discrimination Index。

3.9 Y 迷宫实验 小鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活动10 min，训练结束后，小鼠被放回饲养笼。1 h 后进行第2 个阶段实验。第2 个阶段为检测期，抽开新异臂隔板，小鼠由起始臂放入，在3个臂中自由活动5 min。录像记录5 min 内每只小鼠在各个臂停留的时间和穿梭次数。

4 统计学处理

使用SPSS 21.0 软件对数据进行分析。两组之间比较使用独立样本t检验，数据采用均数±标准误（mean±SEM）表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 母代高脂饮食对子代小鼠运动协调性的影响

小鼠足迹分析结果显示，相比于正常饮食母鼠的子代，高脂饮食组子代小鼠足迹角度显著降低（P＜0.01），见图1A。在转棒实验中，正常饮食组母鼠子代掉落时间逐渐增加，而高脂饮食组子代小鼠在实验的3 d过程中，在转棒停留的时间显著低于正常饮食组母鼠子代（P＜0.01），见图1B。

Figure 1.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on motor coordination of offspring mice.A：statistic results of the foot angle；B：the stay time on the rotarod.Mean±SEM. n=8.**P＜0.01 vs control group.图1 母代高脂饮食对子代小鼠运动协调性的影响

2 母代高脂饮食对子代小鼠运动能力的影响

本实验通过旷场实验研究了母代高脂饮食对子代小鼠运动能力的影响，结果显示，相比于正常饮食母鼠的子代，高脂饮食母鼠子代小鼠直立次数显著降低（P＜0.01），见图2A；实验周期内运动总距离相比于对照组显著降低（P＜0.01），见图2B。并且，高脂饮食母鼠子代小鼠在旷场中心停留时间相比于正常饮食母鼠子代小鼠显著降低（P＜0.01），见图2C。

3 母代高脂饮食对子代小鼠记忆行为的影响

本实验通过水迷宫等实验研究母代高脂饮食对子代小鼠记忆行为的影响，结果显示，相比于正常饮食母鼠的子代，母代高脂饮食子代小鼠逃避潜伏期显著升延长（P＜0.01），平台移除后在平台所在象限停留时间显著降低（P＜0.01），见图3A、B。十字高架迷宫实验结果显示，母代高脂饮食子代相比于对照组连续两次进入不同臂的次数显著降低（P＜0.01），见图3C。在新物体识别和Y 迷宫实验中，母代高脂饮食子代相比于对照组新物体偏好指数显著降低（P＜0.01），见图3D、E。

4 母代高脂饮食对子代小鼠海马神经元结构的影响

免疫荧光染色实验结果显示，母代高脂饮食子代小鼠海马齿状回DCX染色神经元数目相比于正常饮食母鼠的子代显著降低（P＜0.01），说明神经元分化程度显著降低，见图4A。随后我们对DG 区神经元树突结构进行了研究，染色结果显示，母代高脂饮食子代小鼠DG 区神经元树突长度明显降低（P＜0.01），分支程度也显著降低，见图4B。

讨 论

研究表明女性围产期肥胖或高脂饮食摄入会现在增加子代肥胖和代谢紊乱发生率［6］，然而其是否能影响子代运动能力和学习记忆行为却并不清楚。本实验通过转棒实验和旷场实验发现高脂饮食母鼠子代运动协调性和运动能力显著下降，水迷宫实验、新物体识别实验结果显示高脂饮食母鼠子代学习能力显著下降，同时其海马DG 神经元分化程度和复杂程度均下降。在实验选择中，考虑到雌鼠具有生理周期这一现象，对实验结果有较大干扰，在这里我们为了得到确切的观察结果，只纳入了雄性小鼠进行观察，以期得到确切结论。青春后期是许多精神疾病，如精神分裂、抑郁等的高发年龄，在此我们选择青春后期小鼠进行相关实验。

近几十年，肥胖已经逐渐成为世界性的公共卫生问题。肥胖发生的主要原因是能量摄取与支出的平衡失调，然而现在的研究发现青少年肥胖与其母亲围产期肥胖和高脂饮食结构具有显著相关性［7］。有研究报道，孕妇的营养条件尤其是高脂饮食，可直接影响子代棕色脂肪的正常产热［8］。邓佳等［9］报道，母鼠孕期和哺乳期高脂饮食能够诱导子代出现糖脂代谢紊乱，他们同时发现雄性子鼠更易出现肥胖、糖耐量异常、胰岛素抵抗等代谢障碍。邓佳等［10］研究发现母鼠及断乳后高脂饮食能导致子代雄鼠糖脂代谢异常和肠道菌群失调。这些结果提示我们雄性子代对母鼠高脂饮食后果的敏感性。本实验通过16周的高脂饮食喂养母鼠直至哺乳期结束建立母鼠肥胖模型，选取了子代雄鼠作为主要研究对象，以观察母鼠高脂饮食对子代运动能力和学习记忆的影响。小鼠足迹分析和转棒实验结果显示，母鼠高脂饮食可显著降低子代小鼠运动协调性，而在旷场实验中，子代小鼠垂直水平运动能力均受损。我们的实验首次揭示了母鼠高脂饮食对子代雄性小鼠运动能力可以造成损伤。

Figure 2.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on motor ability of offspring mice.Mean±SEM. n=10.**P＜0.01 vs control group.图2 母代高脂饮食对子代小鼠运动能力的影响

Figure 3.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on memory behavior of offspring mice.A：the escape latency in water maze experiment；B：the percentage in the target quadrant；C：the number of cross arm；D：the preference index in new object recognition（NOR）experiment；E：the preference index in Y-maze.Mean±SEM. n=8.**P＜0.01 vs control group.图3 母代高脂饮食对子代小鼠记忆行为的影响

Figure 4.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on neuron maturation of offspring mice.A：representative images of BrdU（red）and DCX（green）immunostaining in the DG and quantitative analysis of the percentage of total BrdU+ cells that were BrdU+DCX+；B：representative images and examples of DCX（red）immunostaining in the DG and quantitative analysis of the total dendritic length of DCX+neurons in the DG.Mean±SEM. n=13.**P＜0.01 vs control group.图4 母代高脂饮食对子代小鼠海马神经元结构的影响

胚胎期是大脑等器官发育形成的关键时期，母体超重或肥胖可引起宫内环境改变，导致胎儿在异常的生长环境中发育，从而精神疾病易感性上升［11］。Zilkha 等［12］报道母鼠高脂饮食可导致子鼠小鼠认知行为改变，并且子代小鼠显示出自闭样行为。周余蕾等［13］曾报道，母鼠高脂饮食可导致子鼠小鼠抑郁样行为，且学习能力受损。然而这些研究都集中在母鼠孕期和哺乳期高脂饮食，母鼠长期高脂饮食导致的肥胖对子代小鼠认知和学习能力的影响并不清楚。与这些结果研究结果类似，我们的实验结果同样显示出子鼠小鼠学习能力受损。在水迷宫实验中高脂饮食母鼠子代小鼠潜伏期延长，在平台撤去后象限停留时间缩短。同时在新物体识别和Y 迷宫实验中，高脂饮食组子代小鼠对新物体的偏好显著下降。同时我们发现在旷场实验中，高脂饮食组子代小鼠中央停留时间下降，在高架十字迷宫中子代穿越次数降低，这些结果提示了子代小鼠可能出现焦虑样行为，然而母代高脂饮食对子代焦虑情绪的影响还需要进一步的实验证明。

在成年海马神经发生过程中，海马DG 区中的成年神经前体细胞可持续分化成成熟神经元，这些神经元对海马依赖的学习记忆和空间运动能力具有重要作用［14-15］。我们对子代小鼠DG区神经元进行了染色分析，实验结果显示母代高脂饮食子代小鼠DG 区神经元分化程度显著降低且神经元树突长度和分支明显降低。我们因此考虑母代高脂饮食通过影响子代小鼠海马神经发生损伤了小鼠运动和学习能力。

综上所述，我们的实验发现母代高脂饮食可损伤子代小鼠运动协调性和运动能力，同时小鼠显示出学习记忆障碍，其机制可能与子代小鼠海马神经发生损伤有关。然而本实验结果仅来自于雄性子代小鼠，关于母代高脂饮食对子代雌性小鼠运动和学习能力的作用，以及子代性别在其中的差异及原因还需要进一步研究。