情志刺激加速小鼠动脉硬化进展与SDF-1/CXCR4失衡的相关性研究*

黄曾艳， 黄曼萍， 彭春丽， 刘永源， 李春燕， 梁东辉

（1南方医科大学中医药学院，广东广州510515；2广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405；3南方医科大学珠江医院，广东广州510280；4茂名市人民医院，广东茂名525000）

易损动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）斑块进展和破裂引起的血小板聚集和血栓形成是导致急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）等急性心脑血管事件的病理学基础［1］。近年来，临床就诊的ACS 患者中精神心理问题突出，忽视对精神心理因素的干预可导致ACS 患者的治疗依从性、临床预后和生活质量显著下降［2］。因此，重视精神心理问题并给予早期防治，有助于稳定AS 斑块，防止ACS的发生和发展，减少发病率与病死率。

研究发现，基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）被认为是冠心病的易感基因［3］，血浆SDF-1 水平是预测心肌梗死病人发生死亡、再梗和心衰等事件的独立危险因素［4］。CXC 趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）是目前研究较多的趋化因子，可特异性地结合SDF-1并互相形成生物信号关联，广泛参与AS 的发生发展过程。

本研究以SDF-1 和CXCR4 与情志刺激小鼠AS病变进展的相关性为出发点，通过慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）的方法干预载脂蛋白E 基因敲除（apolipoprotein E gene knockout，ApoE-/-）小鼠，从而复制ApoE-/-小鼠 CUMS情志刺激模型［5］，观察AS斑块组织病理学形态，同时检测SDF-1和CXCR4在血浆、血小板、主动脉和海马中的表达，观察情志刺激与AS 斑块易损性的相关性，为SDF-1/CXCR4 介导的动脉粥样硬化病变下游信号通路的研究奠定基础。

材 料 和 方 法

1 实验动物

从常州卡文斯实验动物有限公司购进30 只雄性ApoE-/-小鼠和10 只具有相同遗传背景的野生型C57BL/6J 小鼠，SPF 级，8 周龄，体质量为（22±1）g，动物许可证号为SCXK（苏）2011-0003。

2 主要试剂及仪器

小鼠SDF-1 和CXCR4 ELISA 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；鼠抗SDF-1 多克隆抗体和鼠抗CXCR4 单克隆抗体（Abcam）；抗GAPDH 抗体（北京全式金生物技术有限公司）；聚合HRP 标记的IgG Ⅱ抗（武汉博士德生物科技有限公司）；DAB 显色液（广州赛国生物公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（广州碧云天生物技术研究所）。RM2235 切片机（Leica）；TS100-F 型荧光倒置显微镜（Nikon）；MK3 酶标定量测定仪（Thermo）；SDS 电泳系统（北京君意东方电泳设备有限公司）。

3 方法

3.1 分组及造模 30 只8 周龄雄性ApoE-/-小鼠，造模前给予基础饲料适应性喂养1 周后，按照数字表法随机分为正常对照（normal control）组、高脂（high fat）组和CUMS 情志刺激模型组（CUMS 组），每组各10只，另取10只同周龄近交系C57BL/6J小鼠设为空白对照（blank control）组。小鼠饲养环境相同（饲养条件SPF 级，室温22℃～24℃，相对湿度为50%，光照时段为7：00～19：00），自由饮水。空白对照组和正常对照组小鼠给予普通饲料喂养；高脂组小鼠全程给予含脂肪21%和胆固醇0.15%的西方膳食饲料（60Co γ 射线灭菌，北京科澳协力有限公司）喂养，无其他干预；CUMS 情志刺激模型组小鼠给予高脂饲料喂养的同时，加用CUMS 方法干预12周，从而复制ApoE-/-小鼠 CUMS 情志刺激模型［5］。实验共进行13周。

3.2 CUMS情志刺激造模 本研究采用国际公认的CUMS 方法复制ApoE-/-小鼠情志刺激模型［5］，具体方法如下：（1）倾斜鼠笼：让小鼠保持在倾斜45°的鼠笼6 h；（2）湿润环境：用水将垫料弄湿（避免加水过多产生大水池），将小鼠放置在此潮湿环境6 h；（3）快速灯光交换+白噪音：将小鼠置于暗箱中，自动定时器每隔7 min 交换明暗灯光，同时结合白噪音（110 db）刺激小鼠，持续2 h；（4）整晚照明：小鼠从7：00 pm-7：00 am 被置于明亮灯光室过夜；（5）孤立后群居：每只小鼠单独放置在一个笼子持续4 h 后，再将10 只小鼠共同放置在1 个笼子里持续2 h（观察小鼠，如果发生斗殴则人为分开）；（6）禁食24 h；（7）禁水24 h；（8）夹尾：用重量约800 g的塑料夹夹在距离小鼠尾根1～1.5 cm 处（纱布包住尾巴以免夹伤造成组织伤害），持续15 min 后，将夹子取下。以上几种CUMS 干预方法随机安排，相同刺激不连续加入，使ApoE-/-小鼠不能预知次日的刺激，避免小鼠因适应刺激而影响干预结果。每日CUMS 刺激前后观察各组ApoE-/-小鼠的一般状况，重点记录小鼠行为状态，如行动活跃度、兴奋程度、皮肤毛发、饮食、睡眠等内容。

3.3 检测指标及方法 各组小鼠到达实验时点后取材，取材前小鼠禁食禁水12 h，无菌条件下，依据每只小鼠体重使用1%戊巴比妥钠不同剂量腹腔注射麻醉后：（1）经摘除眼球取血，选用洗涤法分离纯化血浆、血小板；（2）无菌条件下解剖小鼠，迅速打开胸腔和腹腔，从主动脉弓处轻轻分离主动脉至髂动脉分支处；（3）无菌手术剪剥除颅骨，于四叠体中部向前倾斜30°剖开脑组织，取海马区新鲜脑组织；（4）无菌条件下暴露并取出整条股骨、胫骨，Hanks液反复冲洗骨髓，收集骨髓细胞混悬液，离心弃上清后保存备用。

3.3.1 血浆SDF-1 和CXCR4 含量的检测 严格依照ELISA 试剂盒说明书，进行标准品的稀释、加样、酶标板上盖、覆膜、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止。终止反应15 min 内，选择450 nm 波长，测量各孔的吸光度，依据标准品的吸光度创建相应的标准曲线，从而算出小鼠血浆SDF-1 和CXCR4的水平。

3.3.2 冷冻切片油红O 染色观察主动脉病理损伤程度 实验末小鼠处死后，各组小鼠行主动脉冷冻切片油红O 染色，具体步骤如下：（1）载玻片粘取冷冻切片，切片干燥后入60%异丙醇浸洗10 min；（2）油红O 工作液染色10 min；（3）60%异丙醇分化3～10 s至间质清晰，水洗；（4）Mayer苏木精复染1 min，自来水返蓝；（5）滤纸吸干水分，甘油明胶封片。依据每个标本连续切片的染色结果，选择AS 斑块面积最大的切片做病理形态学分析。

3.3.3 免疫组织化学染色检测主动脉内SDF-1 和CXCR4 的表达 实验末小鼠处死后，各组小鼠主动脉行石蜡切片，烤片，脱蜡至水；3% H2O220 min；PBS 洗 3 min×3 次；0.05% 胰蛋白酶 37℃ 30 min；PBS 洗3 min×3 次；37℃封闭1 h；吸去封闭液，滴加Ⅰ抗（抗 SDF-1 抗体 1∶250 稀释，抗 CXCR4 抗体 1∶500 稀释），4℃过夜；37℃复温1 h；PBS 洗3 min×3次；滴加聚合HRP 标记的抗小鼠IgG Ⅱ抗，室温孵育1 h；PBS洗3 min×3次；DAB显色；充分水洗；苏木素染色1 min；水洗；分化数秒；氨水返蓝10 min；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封片；59℃烤箱过夜。

显微镜下观察：阳性细胞为抗原呈颗粒状、或弥漫性棕黄色或棕褐色着色。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析仪分析小鼠主动脉阳性产物的积分吸光度（integrated absorbance，IA）及 血 管 总 面 积（sum area），IA/sum area 即为平均吸光度（mean absorbance，MA）。

3.3.4 Western blot 检测ApoE-/-小鼠血小板、主动脉、海马和骨髓中SDF-1 和CXCR4 的蛋白表达 各组小鼠分别提取主动脉、海马组织蛋白，提取血小板、骨髓细胞蛋白，加入细胞裂解液，低温机器匀浆混匀，10 000 r/min 离心 3 min，取上清，根据 BCA 蛋白定量试剂盒说明书测定样品蛋白含量后制样。分别按照各自计算的上样量上样，进行SDS-PAGE，行湿转法蛋白转膜，脱脂奶粉快速封闭30 min。特异性抗体按比例稀释（抗 SDF-1 抗体1∶250 稀释，抗CXCR4 抗体1∶500 稀释），封口，4℃孵育过夜；HRP标记的Ⅱ抗（1∶1 000 稀释）室温孵育1 h。经洗涤、显影、灰度扫描后，用ImageJ 图像分析软件对电泳条带进行测定，分别以目的条带灰度与内参照GAPDH灰度的比值表示SDF-1和CXCR4蛋白的表达水平。

4 统计学处理

运用SPSS 19.0 软件进行统计学处理。实验数据用均数±标准差（mean±SD）表示。连续性变量指标组间差异显著性检验采用单因素方差分析（oneway ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠行为的变化

ApoE-/-小鼠行为变化的记录结果显示，与其余组比较，情志刺激模型组ApoE-/-小鼠表现出行动活跃度、灵活性、兴奋度减低，皮肤毛发光泽度减少，喜欢贴边、眯眼、嗜睡和觅食活动减少等行为学异常状态。

2 ELISA法检测小鼠血浆中SDF-1和CXCR4的表达水平

空白对照组血浆中SDF-1 和CXCR4 的水平最低，CUMS 情志刺激模型组最高；与空白对照组相比，正常对照组、高脂组和CUMS 情志刺激模型组SDF-1 和CXCR4 的含量显著升高（P＜0.05）；与正常对照组比较，高脂组和CUMS 情志刺激模型组SDF-1和 CXCR4 的含量显著升高（P＜0.05）；与高脂组相比，情志刺激模型组SDF-1 和CXCR4 的含量显著升高（P＜0.05），见图1。

3 小鼠主动脉的病理形态观察

冷冻切片油红O 染色通过检测含脂泡沫细胞及其组成的粥样斑块判断主动脉的粥样硬化程度。空白对照组小鼠的主动脉各层排列整齐，结构清晰，细胞形态良好，少见皱褶、空泡，无AS病灶，见图2A；其余3 组小鼠的主动脉均存在不同程度的AS 病变，粥样硬化区域脂质呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色；正常对照组处于脂纹期，AS 病灶可见少量泡沫细胞聚集于部分内膜下，见图2B；高脂组和CUMS 情志刺激模型组以粥样斑块和复合斑块为主要表现，细胞成分减少，脂质成分较丰富，大量泡沫细胞崩解，纤维及基质成分增加，斑块深部为大量无定形坏死物质，为AS 最具特征性的病变，见图2C、D；其中CUMS情志刺激组小鼠AS斑块所占动脉管腔面积最大，呈现薄纤维帽、大坏死核、中膜裂隙和大量针状空隙胆固醇结晶，脂质池较大，不稳定斑块已发生破裂，见图2D。

Figure 1.Plasma levels of SDF-1 and CXCR4 in the mice of different groups.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs blank control group；△P＜0.05 vs normal control group；▲P＜0.05 vs high fat group.图1 各组小鼠血浆SDF-1和CXCR4水平的比较

Figure 2.Pathological changes of aortas in mice from different groups observed by oil red O staining（×200）.A：blank control group；B：normal control group；C：high fat group；D：CUMS group.图2 各组小鼠主动脉病理学改变

4 免疫组化法检测各组小鼠主动脉组织中SDF-1和CXCR4的蛋白表达

免疫组化结果显示，SDF-1 和CXCR4 主要表达于小鼠主动脉平滑肌细胞和内皮细胞胞浆中。其中SDF-1阳性表达产物呈棕褐色颗粒，在空白对照组中表达微弱，接近阴性；在正常对照组中表达较少，着色浅，呈浅棕褐色；在高脂组和CUMS 情志刺激模型组中可见大量阳性表达颗粒，主要表达于AS 斑块纤维帽的平滑肌细胞胞浆中，颜色呈深棕褐色，见图3A。CXCR4 阳性表达产物呈棕黄色弥漫性着色，在空白对照组中表达较少，着色不连续，呈浅黄色；在正常对照组中表达较空白对照组强，着色连续，颜色较深；在高脂组和CUMS 情志刺激模型组中除血管及斑块纤维帽的平滑肌细胞和内皮细胞中表达呈强阳性外，在斑块内的泡沫细胞上也有表达，呈深棕黄色，见图3B。

比较各组小鼠主动脉SDF-1和CXCR4阳性产物的MA值显示：与空白对照组相比，正常对照组、高脂组和CUMS 情志刺激模型组SDF-1 和CXCR4 的表达显著升高（P＜0.05）；与正常对照组比较，高脂组和CUMS 情志刺激模型组SDF-1 和CXCR4 的表达水平显著升高（P＜0.05）；与高脂组相比，CUMS情志刺激模型组SDF-1 和CXCR4 的表达水平显著升高（P＜0.05），见图3C、D。

Figure 3.Detection of SDF-1 and CXCR4 expression in aortas of mice by immunohistochemical staining.A and B：the expression of SDF-1 and CXCR4 in aortas was detected by immunohistochemistry；C and D：the MA values of SDF-1 and CXCR4.a：black control group；b：normal control group；C：high fat group；d：CUMS group.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs blank control group（a）；△P＜0.05 vs normal control group（b）；▲P＜0.05 vs high fat group（c）.图3 免疫组化法检测各组小鼠主动脉SDF-1和CXCR4表达及MA值的比较

5 情志刺激对ApoE-/-小鼠血小板、主动脉、海马和骨髓中SDF-1和CXCR4蛋白表达的影响

与空白对照组比，正常对照组、高脂组和CUMS情志刺激模型组小鼠血小板、主动脉和海马SDF-1和CXCR4 蛋白表达显著增高（P＜0.05），骨髓SDF-1和CXCR4 蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与正常对照组比，高脂组和CUMS 情志刺激模型组小鼠血小板和主动脉和海马SDF-1和CXCR4蛋白表达显著增高（P＜0.05），骨髓SDF-1 和CXCR4 蛋白表达显著降低（P＜0.05）。与高脂组相比，CUMS 情志刺激模型组血小板、主动脉和海马SDF-1 和CXCR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），骨髓SDF-1 和CXCR4 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图4。

讨 论

目前，随着“生物-心理-社会医学”模式的发展，不良情绪如焦虑、抑郁等精神心理因素与ACS 的关系逐渐受到人们的重视。基于对ACS 患者精神心理问题的长期观察研究和临床实践，我们发现不良的情志刺激是ACS 发病的重要因素，给予ACS 患者常规基础用药的同时，重视精神心理治疗和中医疏肝理气中药的运用，对缓解ACS 患者的症状和稳定病情具有确切的疗效［6-8］。本研究采用国际公认的CUMS应激方法，通过长时间、低强度的环境干扰、心理干预ApoE-/-小鼠，造成小鼠紧张、焦虑、抑郁等不良应激反应及异常的行为学状态，从而有效地复制了ApoE-/-小鼠情志刺激模型［5］，且油红 O 染色显示CUMS组小鼠含脂泡沫细胞量高，主动脉发生了最严重的AS 病变，说明不良的情志刺激加速了小鼠动脉硬化进展。

Figure 4.The effects of emotional stimulation on SDF-1 and CXCR4 protein expression in the platelets，aortas，hippocampus and bone marrow of mice.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs blank control group；△P＜0.05 vs normal control group；▲P＜0.05 vs high fat group.图4 SDF-1和CXCR4蛋白在小鼠血小板、主动脉、海马及骨髓组织中的表达

SDF-1 又称 CXCL12，属于 CXC 类趋化因子亚家族成员，来源于骨髓微环境中的基质细胞，作为造血干/祖细胞、单核淋巴细胞、巨核细胞和嗜中性粒细胞的化学引诱物［9］，它不仅在炎症及免疫监督方面发挥重要作用，同时也调节着血小板祖细胞间的相互作用，驱动血小板修复机制［10］。在超过100 000 例患者的全基因组关联研究中发现，编码序列位于10q11 的SDF-1基因被认为是冠心病的易感基因［3，11］，血浆 SDF-1 水平是预测心肌梗死病人发生死亡、再梗、心衰等事件的独立危险因素［4］，与本研究中CUMS情志刺激小鼠骨髓SDF-1水平降低，血浆和血小板SDF-1水平升高结果一致。

CXCR4 属于G 蛋白偶联趋化因子受体，可与其配体SDF-1 特异性结合，从而激活下游的信号分子如联络黏附激酶、蛋白激酶C、细胞外信号调节激酶和核因子κB 等信号转导通路［12］。大脑内源性的趋化因子系统，包括SDF-1/CXCR4，可作为大脑的第三大系统，与神经递质和神经肽系统一起协同调节大脑功能［13］。海马属于边缘系统重要结构之一，参与心理应激的神经内分泌和情绪调节，与抑郁等不良情绪的发生有因果关系［14］。作为AS 的始动环节，SDF-1 可上调CXCR4 表达，促进单核细胞黏附、聚集至内皮损伤部位，并进一步迁移入内膜下形成巨噬细胞，巨噬细胞又可摄取氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），形成在AS 发生过程中起关键作用的泡沫细胞；SDF-1/CXCR4 也可引起ox-LDL 介导的血管平滑肌细胞发生异常迁移与增殖，并抑制其凋亡，加速AS 的发生、发展，与本研究中CUMS 情志刺激干预的ApoE-/-小鼠主动脉和海马中SDF-1和CXCR4水平升高的结果一致。

鉴于AS 病变与血浆、血小板、骨髓和海马中SDF-1/CXCR4 表达的相关性，本研究对ApoE-/-小鼠采取CUMS结合高脂饮食喂养建立AS易损斑块动物模型，以SDF-1/CXCR4的变化为主要观察靶点，研究表明情志刺激状态下，CUMS 小鼠血浆、血小板、主动脉和海马中SDF-1 和CXCR4 的水平增加，骨髓中SDF-1 和CXCR4 的水平降低，与冷冻切片油红O 染色显示CUMS 小鼠主动脉粥样硬化程度最重的病理结果一致，由此可见CUMS 情志刺激引起了SDF-1/CXCR4 表达失衡，并且加速了AS 进展，也进一步证实了情志刺激是引起AS 斑块不稳定和破裂的重要因素之一。