PAX6抑制血管紧张素II诱导的心脏成纤维细胞转分化*

丛雯雯， 冯晔囡 ， 王帅星， 胡国民， 肖 晗， 司军强 ，4△， 张幼怡△

（石河子大学医学院 1新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，2生理学教研室，新疆石河子832000；3北京大学第三医院心内科，血管医学研究所，国家卫生健康委心血管分子生物学与调节肽重点实验室，分子心血管学教育部重点实验室，心血管受体研究北京市重点实验室，北京100191；4华中科技大学同济医学院基础医学教研室，湖北武汉430030）

心肌纤维化是冠心病、高血压、心肌病等多种心血管疾病发生心力衰竭、恶性心律失常甚至心源性猝死等严重并发症的重要病理改变。心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）是参与心肌纤维化的主要细胞类型。在心肌损伤等刺激时，CFs 迁移、增殖并转化为肌成纤维细胞，分泌大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，最终导致室壁顺应性降低，心脏舒张功能障碍［1-3］。因此，深入研究CFs 转分化的机制及其干预靶点具有重要意义。本课题组前期研究已经证实转录因子配对盒因子6（paired box 6，PAX6）在纤维化心脏组织中表达下调，且抑制CFs 中 PAX6 的表达能够引起 CFs 的转分化［4］。这一结果提示，内源性PAX6 的表达对于维持CFs 的表型至关重要。然而，增加PAX6的表达是否能够作为有效的干预方式抑制病理刺激下CFs转分化仍不清楚。鉴于此，本研究拟通过腺病毒载体过表达PAX6的方式增加CFs 中PAX6 的表达，利用血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）诱导CFs的转分化，观察PAX6对Ang II诱导的CFs转分化的作用并探究其机制。

材 料 和 方 法

1 动物

8 周龄雄性C57BL/6 小鼠购自北京大学医学部实验动物中心［许可证号为SCXK（京）2016-0010］，用于分离成年小鼠CFs。动物饲养和使用均完全遵照北京大学医学部实验相关伦理标准，批准号为LA2016-018。

2 材料

过表达PAX6的腺病毒（Ad-PAX6）和对照腺病毒（Ad-GFP）购自上海汉恒生物科技有限公司；Ang II购自Sigma-Aldrich；胶原酶II 和DMEM 培养液购自Gibco；胎牛血清购自Ausbian；逆转录试剂盒购自Promega；TRIzol、Hoechst 33342 和 Alexa Fluor®568 偶联的荧光II抗购自Invitrogen；抗PAX6抗体、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体、抗转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）抗体和抗纤连蛋白（fibronectin，FN）抗体购自Abcam；抗 I 型胶原（collagen type I，Col I）抗体购自MD Bioproducts；抗 GAPDH 抗体购自 Cell Signaling Technology；山羊抗兔IgG（H+L）II抗购自中杉金桥公司。

3 方法

3.1 成年小鼠CFs 的分离与培养 取8 周龄雄性C57BL/6小鼠，断颈后用乙醇消毒，立即取出心脏，修剪心耳和主动脉。去除血块后剪碎，加入酶液（0.1%胶原酶II）置于恒温磁力搅拌器中，整个消化过程在37℃恒温下进行。8 min 后吸取上清液，加入等体积含10%胎牛血清的DMEM 培养液，混合均匀。重复8～10 次，直至心脏消化完全。细胞悬液以室温1 000 r/min 离心 5 min，用 DMEM 培养液再洗涤 1 次，继而用DMEM 培养液将细胞重悬，种于10 cm 的细胞培养皿中（3～4 只心脏），于37℃、5%CO2培养。差速贴壁2 h 后，去除未贴壁细胞，剩余已贴壁的细胞主要为成纤维细胞。通过免疫荧光标染波形蛋白（vimentin）对分离培养的 CFs 进行鉴定，vimentin 阳性的细胞比率大于92%。24 h 后更换新鲜的培养液继续培养，此时培养皿中贴壁的CFs 为P0。传代至第2代（P2）时进行病毒感染。

3.2 实验分组 实验分为Ad-GFP+Ctrl组（感染Ad-GFP）、Ad-GFP+Ang II 组（感染Ad-GFP 24 h 后，加入10-6mol/L Ang II 继续处理 24 h 或 48 h）、Ad-PAX6+Ctrl 组（感染 Ad-PAX6）和 Ad-PAX6+Ang II 组（感染Ad-PAX6 24 h 后，加入 10-6mol/L Ang II 继续处理 24 h或48 h）。

3.3 病毒感染 待P2 的CFs 融合度达到50%～60%时，更换为无血清培养液，分别加入Ad-GFP 和Ad-PAX6，以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为2 感染6～8 h，再更换为完全培养液继续培养至24 h和48 h。采用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光强度；采用qPCR和Western blot检测PAX6表达情况。

3.4 Western blot 收集各组细胞，用BCA法检测蛋白浓度，取等质量蛋白进行SDS-PAGE，转移蛋白至PVDF 膜，用TBST 配制的5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入1∶2 000 稀释的兔抗PAX6、Col I、FN、α-SMA 和TGFβ1 抗体，4℃摇床孵育过夜。次日TBST 洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的II 抗，室温孵育1 h，使用GeneSys 机器ECL 发光成像。用ImageJ 图像分析软件对每个条带的灰度值进行定量分析。

3.5 固定细胞免疫荧光技术 用4%多聚甲醛室温固定细胞 20 min，PBS 洗 3 次后，Triton X-100 室温破膜20 min，再用PBS洗3次；加入1%牛血清白蛋白室温封闭30 min；加入Ⅰ抗于4℃孵育过夜；次日PBS洗 3 次后，加入 Alexa Fluor®568 偶联的荧光 II 抗 4℃孵育 1 h，PBS 洗 3 次；Hoechst 33342 染细胞核 6 min。之后利用高内涵显微镜观察制备好的样品。利用高内涵显微镜Array Scan 系统采集各通道荧光，根据细胞核计数并圈画荧光统计面积。结果表示为平均荧光强度，即为单个细胞单位面积的荧光强度。

3.6 qPCR 用Trizol 试剂提取细胞样品总RNA，逆转录后进行qPCR 检测。以GAPDH 为内参照，通过2-ΔΔCt法比较目的基因的表达差异。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，序列见表1。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 统计学处理

采用Prism 8.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准误（mean±SEM）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素方差分析（two-way ANOVA），多重比较采用 Tukey 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Ad-PAX6感染CFs后PAX6过表达效果验证

过表达小鼠PAX6 腺病毒的结构示意图见图1A。感染48 h 后，倒置荧光显微镜下观察，在感染Ad-GFP 和Ad-PAX6 的大部分细胞内均可见绿色荧光，且两组细胞的形态无明显异常，见图1B。qPCR和Western blot 检测结果显示，与未感染的对照组和感染对照病毒的Ad-GFP 组相比，感染过表达PAX6腺病毒的 Ad-PAX6 组 CFs 中 PAX6 的 mRNA 和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），见图1C、D。

2 过表达PAX6 抑制CFs 中Ang II 引起的肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达

Western blot 结果显示，在感染Ad-GFP 的CFs中，Ang II 处理能够增加肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达（P＜0.01）；而在感染Ad-PAX6的CFs中，Ang II 处理组与对照组相比，α-SMA 的表达无显著变化（P＞0.05）；与 Ad-GFP+Ang II 组相比，Ad-PAX6+Ang II 组α-SMA 表达显著降低（P＜0.01），见图2A。细胞免疫荧光结果同样显示，对感染Ad-GFP的CFs 给予Ang II 刺激，α-SMA 的平均荧光强度显著增加（P＜0.01）；而对感染 Ad-PAX6 的 CFs 给予Ang II刺激，α-SMA 的平均荧光强度无显著变化（P＞0.05）；与 Ad-GFP+Ang II 组相比，Ad-PAX6+Ang II组α-SMA 的平均荧光强度显著降低（P＜0.05），见图2B。

3 过表达 PAX6 抑制 CFs 中 Ang II 引起的 ECM 蛋白的表达与分泌

Western blot 结果显示，在感染对照病毒Ad-GFP的CFs 中，Ang II 处理能够显著增加ECM 蛋白Col I（P＜0.01）和 FN（P＜0.05）的表达；而在感染 Ad-PAX6 的CFs 中，Ang II 处理组与对照组相比，Col I和FN 的表达无显著变化；Ad-PAX6+Ang II 组细胞中Col I（P＜0.01）和FN（P＜0.05）的表达较Ad-GFP+Ang II 组显著降低，见图3A、B。细胞免疫荧光结果同样显示，对感染Ad-GFP 的CFs 给予Ang II 刺激，Col I和FN的平均荧光强度均显著增加（P＜0.01）；而对感染 Ad-PAX6 的 CFs 给予 Ang II 刺激，Col I 和 FN平均荧光强度无显著变化（P＞0.05）；Ad-PAX6+Ang II组 Col I 和 FN 平均荧光强度较 Ad-GFP+Ang II 组显著降低（P＜0.01），见图3C、D。

Figure 1.Verification of PAX6 overexpression in CFs.A：the structure schematic of the adenovirus engineered to overexpress mouse PAX6；B：fluorescence observation for the adenovirus infection efficiency after 48 h（scale bar=200 μm）；C：the mRNA expression of PAX6 detected by qPCR；D：the protein expression of PAX6 detected by Western blot.Mean±SEM. n=5～6.**P＜0.01 vs control（Ctrl）group and Ad-GFP group.图1 腺病毒Ad-PAX6转染CFs后PAX6过表达效果验证

Figure 2.Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced α-SMA expression in CFs.A：the protein level of α-SMA detected by Western blot；B：representative images of immunofluorescence staining（scale bar =150 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA.Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.图2 过表达PAX6抑制CFs中Ang II诱导的α-SMA表达

4 过表达 PAX6 抑制 CFs 中 Ang II 引起的 TGFβ1表达

qPCR和Western blot结果显示，在感染对照病毒Ad-GFP 后给予 Ang II 刺激，CFs 中 TGFβ1 的 mRNA（P＜0.01）及蛋白（P＜0.05）水平显著升高；而在感染Ad-PAX6 后给予 Ang II 刺激，TGFβ1 的 mRNA 及蛋白水平无显著变化（P＞0.05）；同时，Ad-PAX6+Ang II组TGFβ1 的mRNA（P＜0.01）及蛋白（P＜0.05）水平较Ad-GFP+Ang II组显著降低，见图4。

Figure 3 Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced collagen type I（Col I）and fibronectin（FN）synthesis in CFs.A，B：the protein expression of Col I and FN detected by Western blot；C，D：representative images of immunofluorescence staining（scale bar =150 μm）and average fluorescence intensity of Col I and FN.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.图3 过表达PAX6抑制CFs中Ang II诱导的Ⅰ型胶原和纤连蛋白的合成

讨 论

本研究结果表明，过表达PAX6 可以抑制Ang II诱导的CFs 转分化及ECM 蛋白的表达与分泌，这一作用可能是通过抑制TGFβ1 表达而实现的（图5）。因此本研究结果提示，增加PAX6表达可以发挥抗心肌纤维化的作用。

PAX6 是配对盒因子家族中的一员，在视网膜形成及其他眼组织发育与疾病中发挥关键的转录调节作用［5］。除此之外，PAX6 在脑神经系统、胰腺及多种肿瘤中均已有深入研究。PAX6 基因突变将导致前脑、鼻结构以及胰岛的发育与形态异常［6-7］。PAX6启动子区的甲基化与膀胱癌、非小细胞肺癌等癌症的复发与低生存率正相关［8-9］。然而目前PAX6 在心脏疾病中的相关研究较少，有研究利用转录因子结合位点分析和蛋白质/DNA 阵列分析的方法，发现PAX6 的DNA 结合活性在病理性心肌肥厚中显著高于生理性心肌肥厚［10］，提示PAX6可能参与调控病理性心肌肥厚过程。我们之前的研究表明抑制内源性PAX6的表达能够促进CFs转分化［4］。但是一些研究表明，过高或过低的PAX6表达水平均可产生病理效应。例如，视网膜母细胞瘤细胞中PAX6表达水平的增加和降低均抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的增殖［11-12］。因此有必要进一步明确过表达PAX6对心脏CFs 转分化的调控作用。在本研究中，我们利用腺病毒载体过表达PAX6以增加CFs中PAX6的表达，发现过表达PAX6 并不引起正常CFs 的转分化，而是抑制病理刺激（Ang II）引起的CFs 转分化。因此，我们的研究表明维持CFs 中PAX6 的高表达对抑制心肌纤维化具有重要意义。

Figure 4.Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced TGFβ1 expression in CFs.A：the mRNA expression of TGFβ1 detected by qPCR；B：the protein expression of TGFβ1 detected by Western blot.Mean±SEM. n=5～6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.图4 过表达PAX6抑制Ang II诱导的CFs中TGFβ1的表达

Figure 5.A schematic model describing how paired box 6（PAX6）inhibits angiotensin II（Ang II）-induced cardiac fibroblast（CF）transdifferentiation.Transforming growth factor β1（TGFβ1）induces CF transdifferentiation and extracellular matrix synthesis.Our study indicates that PAX6 inhibits Ang II-induced CF transdifferentiation by inhibiting TGFβ1 expression.图5 PAX6抑制Ang II诱导CFs转分化的模式图

本研究利用Ang II 诱导CFs 转分化，构建CFs 的转分化模型，阐明了PAX6 对Ang II 诱导的CFs 转分化发挥抑制作用。但值得注意的是，在肝星状细胞中的一项最新研究表明，PAX6对肝脏纤维化起促进作用［11］。肝星状细胞的激活是肝脏纤维化的关键环节。该研究发现，PAX6 促进GLI1的转录表达，介导肝星状细胞的激活与增殖［13］。对于PAX6 在心脏和肝脏中功能的差异，我们认为可能是由于PAX6对多种病理过程的调控具有组织特异性。例如，在间脑和大脑皮层中，转录因子PAX6以相反的方向转录调控细胞增殖与分化的平衡。而造成这一差异的原因是大脑皮层存在另一转录因子Foxg1，敲除大脑皮层中Foxg1的表达则可逆转PAX6 对脑皮层细胞增殖与分化的调控作用［14］。另外，在不同的肿瘤组织中，PAX6也会发挥不同的促癌或抑癌作用［15-17］。由此我们推断，由于心脏和肝脏中存在不同转录因子与PAX6 相互作用，共同影响纤维化的进程，因而导致PAX6在肝脏中发挥促纤维化作用，而在心脏中则表现为抗纤维化作用。

TGFβ1 是调控心肌纤维化的关键细胞因子。TGFβ1 促进CFs 转分化为肌成纤维细胞，其下游信号分子Smad3 进入细胞核发挥转录调控作用，介导Col I、Col III、FN 等多种 ECM 蛋白的转录表达［18］。我们前期研究和其他研究表明，Ang II 可以通过转录因子 AP-1 与 HNF-4α 直接促进 TGFβ1 的表达［19-20］，还能够通过调控microRNA 间接促进TGFβ1 的表达［21］。我们之前的研究发现 Ang II 可下调 CFs 中PAX6 的表达水平［4］。而在本研究中，通过外源性增强 PAX6 的表达能够抑制 Ang II 诱导的 TGFβ1 的mRNA 和蛋白表达。因此，本研究提出了PAX6 过表达抑制心脏CFs 转分化的机制可能是通过抑制AngII 引起的TGFβ1 表达增加。鉴于PAX6 能够与Tgfb1内含子特定区域结合并发挥转录抑制作用［2］，过表达PAX6 抑制TGFβ1 表达这一干预方式可能不仅局限于Ang II 模型，而是适用于所有TGFβ1 表达升高的心肌纤维化环境，为未来干预心肌纤维化提供了新思路。

综上所述，本研究进一步证实PAX6对心肌纤维化起保护作用。外源性增加PAX6 的表达能够作为有效的干预方式抑制TGFβ1 的转录表达，进而抑制Ang II诱导的CFs转分化及ECM蛋白的表达与分泌。本研究为心肌纤维化的预防与治疗提供了新的思路与实验证据。