仙方活命饮对滑膜炎大鼠炎症氧化应激水平及NLRP3/Caspase-1通路活性的影响

董桦，杜书浩，荣兵

天津中医药大学第一附属医院，天津300193

滑膜炎是滑膜组织因急性创伤或慢性劳损等刺激导致的一种非感染性炎症，临床表现为关节局部疼痛、肿胀，活动能力受限，严重影响患者的生活［1］。滑膜炎的发生与关节炎症因子的表达密切相关，肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）作为促炎因子，能促使炎症发生，加重患者关节功能障碍［2］。同时炎症使体内氧化与抗氧化作用失衡，导致氧化应激的发生。Nod 样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体能够调节半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活化，诱导细胞炎症，是各种炎症性疾病治疗的靶点。在膝骨关节炎组织中，NLRP3、Caspase-1 mRNA 和蛋白表达显著降低［3］。另外，阻断NLRP3/Caspase-1 通路可下调Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白表达，减轻呼吸道炎症［4］。仙方活命饮出自《校注妇人良方》，具有清热解毒、消肿溃坚、活血止痛的功效，常用于脓疱疮、疖肿、蜂窝组织炎、乳腺炎、化脓性扁桃体炎等属热毒实证者。研究显示，仙方活命饮口服结合关节镜下清理术可明显缩短化脓性膝关节炎的治疗疗程［3］。但其对NLRP3/Caspase-1 通路及关节炎症因子表达影响的研究未见报道。我们于2020年6月—2020年8月通过皮下注射脂多糖（LPS）法建立大鼠背部气囊滑膜炎模型，观察仙方活命饮对滑膜炎大鼠炎症和氧化应激水平的影响，并探讨其与NLRP3/Caspase-1 通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康SD 大鼠95 只，雄雄各半，体质量180～220 g，购自山东大学实验动物中心。符合国家实验室动物伦理保护标准及相关法律规定，按照3R 原则给予实验动物人道的关怀照顾。饲养条件：温度22 ℃，湿度55%，12 h/12 h 光暗循环。适应性饲养1周后用于实验。

1.1.2 仙方活命饮药液 药材饮片来自天津中医药大学第一附属医院中药房。取白芷3 g、贝母6 g、防风6 g、当归尾6 g、甘草节6 g、皂角刺（炒）6 g、穿山甲（炙）6 g、天花粉6 g、乳香6 g、没药6 g、金银花9 g、陈皮9 g混合，常规方法煎煮，于恒温水浴锅中浓缩至含生药2 g/mL。按照人和大鼠体表面积换算给药剂量，则其低、中、高剂量分别对应生药含量4.6、9.2、18.4 g/kg。将药液置于-20 ℃保存，给药前复温。

1.1.3 试剂与仪器 吲哚美辛片（每片25 mg）购自临汾奇林药业有限公司，使用蒸馏水配置，现配现用。LPS 购自北京百奥莱博科技有限公司，使用无菌平衡盐溶液配制成10 mg/mL 溶液，4 ℃保存备用。丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、TNF-α、IL-6 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；苏木精—伊红（HE）染液购自北京四正柏生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS）和β-actin鼠抗均购自美国Sigma 公司；蛋白提取试剂盒、ECL显色试剂盒和BCA 蛋白定量试剂盒均购自北京中山金桥生物科技有限公司；TNF-α、IL-6、NLRP3 和Caspase-1 鼠抗、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗均购自美国Abcam 公司；Fax-20100型酶标仪购自美国INStat 公司；尼康SMZ745 型光学显微镜购自上海普赫生物科技有限公司；ChemiDoc-MP 全能型凝胶成像分析仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 滑膜炎动物模型制备 80 只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉，背部朝上固定于手术台，用8%硫化钠溶液脱去背部被毛备用。用镊子挑起背部肩胛正中区皮肤，皮下注射20 mL 无菌空气（0.22 μm 微孔滤膜过滤针筒内空气）形成气囊；第3 天再次注射10 mL 无菌空气，以维持气囊，第6 天注射10 mL 无菌空气后，接着向气囊中注射LPS 20 μg/kg，待背部气囊皮肤出现红肿且大鼠出现瘙痒不安、挠耳舔足症状，证明造模成功［6］。另取15只大鼠作为对照组，按上述方法制备气囊，于实验第6天向气囊中注射等体积无菌平衡盐溶液。

1.3 动物分组与干预 将造模成功的75 只大鼠使用随机数字表法分为模型组、吲哚美辛组、低、中、高剂量仙方活命饮组，每组各15 只，另取15 只正常大鼠作为对照组。吲哚美辛组给予5 mg/kg 吲哚美辛10 mL/kg 灌胃，低、中、高剂量仙方活命饮组分别给予含生药4.6、9.2、18.4 g/kg 的仙方活命饮药液10 mL/kg 灌胃，对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，于造模完成后，每天给药1次，连续7 d。

1.4 标本采集 各组最后一次给药24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg/kg 麻醉处死，股动脉取血，-80 ℃冰箱保存待用。将大鼠背部朝上固定于手术台上，切开背部气囊皮肤，用4 mL 无钙镁Hank"s 液灌洗气囊，收集灌洗液，4 ℃冰箱保存待用。切取背部滑膜组织，每组取5 份滑膜组织放入4%多聚甲醛固定，用于HE 染色；其余滑膜组织放入冻存管中-80 ℃保存，用于Western blotting检测。

1.5 气囊渗出液量测算和灌洗液中白细胞数量检测 收集气囊灌洗液于10 mL 带刻度的试管中，准确记录灌洗液量，渗出液量=灌洗液量-4 mL。然后用移液器吸取0.02 mL 灌洗液，加入3%冰醋酸0.38 mL，生物显微镜下计数白细胞。

1.6 气囊灌洗液中氧化应激指标MDA、CAT、SOD、GSH检测 采用ELISA法。取气囊灌洗液，3 000 r/min离心15 min（离心半径15 cm），取上清。使用ELISA试剂盒检测MDA、CAT、SOD、GSH含量，按照试剂盒说明书操作，使用酶标仪读取吸光度值，依据标准曲线计算各自含量。

1.7 气囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平检测 采用ELISA 法。取股动脉血和气囊灌洗液，以13 000 r/min 离心15 min，取上清。使用ELISA 试剂盒检测TNF-α、IL-6水平，按照试剂盒说明书操作。

1.8 滑膜组织病理检查 采用HE 染色。取滑膜组织，加入梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片机作约5 μm厚切片。HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

1.9 滑膜组织中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1 蛋白检测 采用Western blotting 法。取滑膜组织，加入蛋白提取液提取总蛋白，使用BCA 试剂盒对蛋白进行定量。取蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF 膜上，脱脂牛奶封闭。分别加入一抗（稀释比例为1∶2 000），4 ℃孵育过夜。加入含辣根过氧化物酶的二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育2 h。使用ECL显色试剂盒显色，全能型凝胶成像分析系统分析灰度值。以β-actin 为参照，计算目标蛋白的相对表达量。

1.10 统计学方法 采用SPSS24.0 统计软件。计量资料以±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两间比较行SNK-q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组气囊渗出液量和灌洗液中白细胞数量比较 见表1。

表1 各组气囊渗出液量和白细胞数量比较（±s）

表1 各组气囊渗出液量和白细胞数量比较（±s）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与仙方活命饮低剂量组相比，cP＜0.05；与仙方活命饮中剂量组相比，dP＜0.05。

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2.2 各组气囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH 含量比较 见表2。

2.3 各组气囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平比较 见表3。

2.4 各组滑膜组织病理特征情况 对照组滑膜组织规则，几乎无炎症细胞浸润；模型组滑膜细胞大量增生，滑膜组织紊乱并伴有大量炎症细胞浸润聚集，组织周边可见缺损；吲哚美辛组滑膜组织细胞排列相对整齐，炎症细胞浸润较少；仙方活命饮低、中、高剂量组滑膜组织细胞排列逐渐整齐，炎症细胞浸润椎间减少，且高剂量组与吲哚美辛组相近。

2.5 各组滑膜组织中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白表达比较 见表4。

表2 各组气囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH含量比较（±s）

表2 各组气囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH含量比较（±s）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与仙方活命饮低剂量组相比，cP＜0.05；与仙方活命饮中剂量组相比，dP＜0.05。

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表3 各组气囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6水平比较（ng/L，-x±s））

表4 各组滑膜组织中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组滑膜组织中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白相对表达量比较（±s）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与仙方活命饮低剂量组相比，cP＜0.05；与仙方活命饮中剂量组相比，dP＜0.05。

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3 讨论

滑膜炎不仅导致滑膜组织受损，引起分泌液失调形成积液，加大关节承受压力；同时炎症因子刺激软骨，严重影响关节的正常功能，给患者带来痛苦。本研究结果显示，滑膜炎大鼠滑膜组织严重增生、结构紊乱并伴有大量炎症细胞浸润聚集，表明滑膜炎大鼠的滑膜组织存在严重损伤；气囊灌洗液中SOD、GSH 含量显著降低，渗出液量显著升高，灌洗液中白细胞数量、MDA、CAT 含量以及灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平显著升高，表明滑膜炎大鼠体内炎症因子水平严重增加，导致上述病理改变。

中医认为，滑膜炎的主要病机是气血痹阻不通，筋脉关节失于濡养所致。抑制炎症因子产生能够改善动物模型中滑膜炎大鼠关节疼痛及炎症反应［7］。目前，采用中医辨证治疗滑膜炎已取得显著成果。赵泽军等［8］报道，板蓝根可降低气囊滑膜炎渗出液中MDA 含量，提高血清SOD 水平，进而减轻氧化应激反应，减少中性粒细胞浸润，降低TNF-α等促炎介质水平，具有明显的抗炎、抗氧化和免疫调节作用。YANG 等［9］报道，白藜芦醇可降低滑膜炎大鼠血清MDA 含量，提高SOD 活性，具有较强的镇痛和抗炎、抗氧化活性。方婷婷［10］报道，仙方活命饮加减辅助布洛芬口服液治疗能提高小儿髋关节滑膜炎的临床疗效，降低髋关节疼痛评分。本研究结果显示，与模型组相比，仙方活命饮低、中、高剂量组背部灌洗液中SOD 和GSH 含量依次升高，滑膜组织中炎症细胞浸润逐渐缓解；大鼠气囊渗出液量、灌洗液中白细胞数量、MDA、CAT 含量以及灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 含量依次降低，提示仙方活命饮对滑膜炎大鼠有积极的治疗作用。

NLRP3/Caspase-1通路是炎症反应的关键通路，NLRP3 抑制剂和Caspase-1 抑制剂均可降低促炎因子含量［11］。研究显示，抑制NLRP3/Caspase-1 信号通路能够抑制小鼠内质网的氧化应激反应，改善缺血再灌注引起的心肌功能障碍［12］；下调NLRP3 表达可显著减弱异氟醚对NLRP3 炎症小体的激活，减少细胞中IL-18、IL-1 分泌［13］。SUN 等［14］报道，异丙酚可通过NLRP3 炎症小体直接诱导Caspase-1 依赖的巨噬细胞焦亡。WANG 等［15］报道，豆蔻素可通过抑制NLRP3 炎症小体的激活，下调结肠炎小鼠结肠中IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1 水平，改善小鼠结肠炎。本研究结果显示，与模型组相比，仙方活命饮低、中、高剂量组大鼠滑膜组织TNF-α、IL-6、NLRP3 和Caspase-1 蛋白表达量依次降低，呈剂量依赖性，提示仙方活命饮可能通过抑制NLRP3/Caspase-1 通路，降低炎症因子TNF-α 和IL-6 表达，缓解滑膜炎大鼠滑膜组织损伤，减少背部渗出液。

综上所述，仙方活命饮可降低炎症因子表达，抑制氧化应激反应，缓解滑膜炎大鼠滑膜组织损伤，减少背部渗出液；其机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1信号通路相关，为临床上使用仙方活命饮治疗滑膜炎提供了理论依据。