尾加压素Ⅱ在高糖诱导心肌细胞氧化应激、内质网应激中的作用及机制研究

支杏敏，张捷，卢东，戴红艳

尾加压素Ⅱ是一种生长抑素样神经环肽，最早发现于硬骨鱼尾部下垂体中，是目前已知最有效的缩血管活性物质[1]。研究发现，尾加压素Ⅱ高表达于糖尿病性心肌病（DCM）的心肌组织中[2]，提示其可能在DCM发病过程中起重要作用，但具体机制尚不清楚。尾加压素Ⅱ在多种细胞中表现出诱导氧化应激、活性氧产生的作用[3]，如尾加压素Ⅱ可以通过诱导心脏成纤维细胞、肺动脉平滑肌细胞等产生活性氧，发挥促增殖作用。活性氧已被证实可以引发内质网应激上游信号分子的产生，从而参与调节并启动细胞凋亡过程[4]，而心肌细胞凋亡是DCM发生发展的重要病理生理机制[5]。因此，尾加压素Ⅱ/氧化应激/内质网应激通路很可能是DCM发病过程中的重要机制之一。本研究为体外实验，观察高糖刺激对心肌细胞中尾加压素Ⅱ及其受体的表达变化，并通过尾加压素Ⅱ受体拮抗剂Urantide阻断尾加压素Ⅱ系统，观察心肌细胞中氧化应激/内质网应激通道及细胞凋亡相关信号分子表达的改变。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料

新生1～2 d清洁级Wistar大鼠乳鼠，由山东鲁抗医药公司提供；羊抗尾加压素Ⅱ多克隆抗体、羊抗尾加压素Ⅱ受体多克隆抗体购自美国Sigma公司；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体、兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein，GRP78）多克隆抗体、小鼠抗大鼠活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）单克隆抗体、兔抗大鼠CCAAT/增强子结合同源蛋白（C/EBPhomologous protein，CHOP）单克隆抗体、兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase-12）多克隆抗体购自英国Abcam公司；尾加压素Ⅱ受体拮抗剂Urantide购自美国Peptides公司；GAPDH以及二氯荧光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihy-drofluorescin diacetate，DCFHDA）购自上海碧云天生物技术有限公司；TAKaRa逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；胎牛血清、细胞培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）购自美国Hyclone公司。

1.2 心肌细胞培养

在无菌条件下，取乳鼠心脏剪碎，用0.125%胰蛋白酶反复消化至组织全部消化，收集每次消化后的胰蛋白酶，用含20%胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化。将收集的细胞悬液用200目滤网过滤后离心、重悬，通过差速贴壁方法获取心肌细胞，接种到35 cm3培养瓶或六孔板上，于37℃，5%二氧化碳（CO2）孵箱培养36 h后进行实验。

1.3 实验设计

用低糖DMEM培养基培养心肌细胞36 h后，将培养的心肌细胞随机分为4组：低糖组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）[6]、高渗组（5 mmol/L葡萄糖+20 mmol/L甘露糖）、高糖+Urantide组，其中高糖+Urantide组用Urantide（10-5mol/L）预刺激45 min，每组6孔，培养24 h后收集心肌细胞。

1.4 细胞内活性氧水平检测[7]

收集各组心肌细胞，用无血清DMEM培养基清洗3次，加入30 μmol/L DCFH-DA 37℃下孵育20 min，不发光的DCFH-DA可以自由透过细胞膜，细胞内的活性氧可将DCFH-DA氧化成具有荧光的DCFH-DA，其荧光强度与细胞内产生的活性氧的量成正比。再用无血清DMEM培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用共聚焦显微镜获得各组细胞图像。采用image-pro plus 6.0软件进行荧光密度分析。

1.5 实时荧光定量PCR检测

按说明用TRIzol提取心肌细胞总RNA，并用紫外分光光度计在260 nm下测量并计算RNA的浓度及纯度。根据TAKaRa逆转录试剂盒说明，将RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。采用Promega的SYBR®Green Ⅰ在荧光定量PCR仪上扩增，建立标准曲线，反应步骤：95℃，10 s，35个循环，62℃退火10 s；72℃延伸10 s进行PCR扩增，在每个循环的延伸期收集荧光信号，并通过熔解曲线分析PCR扩增的特异性。所获数据通过2-ΔΔCt法进行处理，引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.6 免疫印迹 （Western blot）检测

RIPA细胞裂解液与蛋白酶抑制剂Aprotinin按250：1比例消化收集的各组心肌细胞，冰上裂解30 min，剧烈震荡3次，高速离心机离心后取上清，加入适量蛋白上样缓冲液，10 min煮沸。用二喹啉甲酸法[8]测定所得蛋白浓度。用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行电泳分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，然后分别用GRP78多克隆抗体（1：1 000）、ATF6单克隆抗体（1：160）、CHOP单克隆抗体（1：1 000）和caspase-12多克隆抗体（1：1 000）、GAPDH单克隆抗体（1：1 000）4℃摇床孵育过夜，再与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，采用化学发光检测法（ECL显色法）处理蛋白条带。以GAPDH为内参，用Gelpro32软件对结果进行半定量分析。

图1 Western blot法检测高糖刺激对各组细胞内尾加压素Ⅱ及其受体蛋白表达量的影响（n=3）

1.7 统计学方法

用SPSS19.0软件进行统计学处理，并用均数±标准差表示。多组数据间的比较采用单因素方差分析，两组间的数据比较采用成组t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖刺激对心肌细胞内尾加压素Ⅱ及其受体水平的影响（图1）

Western blot法检测结果显示，与低糖组和高渗组相比，高糖组心肌细胞内尾加压素Ⅱ及其受体蛋白表达量显著增高（P＜0.05）。

2.2 高糖刺激下尾加压素Ⅱ对心肌细胞内活性氧水平的影响（图2）

细胞免疫荧光法检测结果显示，与低糖组相比，高糖组心肌细胞中活性氧表达水平明显增高（P＜0.0001）；与高糖组相比，高糖+Urantide组心肌细胞中活性氧表达水平明显降低（P＜0.0001）。

图2 细胞免疫荧光法分析高糖刺激下尾加压素Ⅱ对心肌细胞内活性氧水平的影响（n=3）

2.3 高糖刺激及阻断尾加压素Ⅱ受体后心肌细胞内质网应激及细胞凋亡相关信号分子的变化（图3、4）

通过实时荧光定量PCR、Western blot法检测各组中ATF6、GRP78、CHOP和 caspase-12的表达变化。与低糖组比，高糖组中ATF6、GRP78、CHOP和 caspase-12的mRNA及蛋白的表达量均明显增高（P＜0.05）；和高糖组比，高糖+Urantide组中ATF6、GRP78、CHOP和caspase-12的mRNA及蛋白的表达量均明显降低（P＜0.05）。

图3 实时荧光定量PCR检测高糖刺激下尾加压素Ⅱ对各组细胞ATF6、GRP78、CHOP和caspase-12的mRNA表达的影响（n=3）

图4 Western blot法检测高糖刺激下尾加压素Ⅱ对各组细胞ATF6、GRP78、CHOP和 caspase-12的蛋白表达的影响（n=3）

3 讨论

目前，我国死于糖尿病并发症的人数比例日益增加，其中DCM已成为加速糖尿病患者死亡的重要原因之一。DCM组织形态学主要表现为心肌细胞凋亡、变性、炎症反应[9]等，其中心肌细胞凋亡是其最重要的病理改变[5]。研究证实，不论是糖尿病患者[10]，还是糖尿病动物模型[5]，其心肌细胞凋亡均明显增加。而采用不同手段降低心肌组织中心肌细胞凋亡后，可预防或减轻DCM患者心功能恶化[11]。因此，心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病变过程中发挥了重要作用，但其相关机制尚不完全明了。

尾加压素Ⅱ是生长抑素类似的环状血管收缩肽，其缩血管效能可达内皮素-1的10倍[1]。在终末期心力衰竭患者心肌组织及心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌组织[2]中，均检测到尾加压素Ⅱ及其受体表达增高。DCM时尾加压素Ⅱ及其受体表达明显增高[12]。因此，尾加压素Ⅱ系统的激活很可能参与并调控DCM过程中心肌细胞凋亡。

内质网应激是近年才发现的一种新的凋亡途径，参与多种疾病及病理状态下的细胞凋亡。当内质网处于应激状态时，内质网的分子伴侣如GRP78、葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94，GRP94）和钙网蛋白的产生都会相应增加[10]，其中GRP78是内质网应激反应的标志蛋白[13]，会与错误折叠的蛋白或未折叠的蛋白相结合，阻止这些蛋白的合成并使它们在内质网中重新排列折叠或进入降解途径，以便能够修复内质网。内质网应激通常可以激活转录因子ATF6[14]。ATF6是内质网应激引起细胞凋亡和自噬途径中的一个重要的调节因子，严重或长时间的内质网应激损伤内质网功能时，它能够启动由内质网应激所介导的凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。内质网应激诱导的下游凋亡信号通路包括[15-17]：CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白或生长停滞及DNA损伤诱导基因153（CHOP/GADDl53）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase）通路。内环境平稳状态下，CHOP和caspase-12的表达很弱，当稳态失衡时，细胞发生内质网应激，CHOP和caspase-12的表达明显升高，过度表达的CHOP和caspase-12会促使细胞周期停滞或甚至导致细胞凋亡。

研究证实，内质网应激不但与糖尿病的发病密切相关[18]，还参与糖尿病多种并发症的发生发展，如糖尿病大血管病变、糖尿病肾病及糖尿病视网膜病变。在体外，高糖能诱导血管内皮细胞[19]、大鼠系膜细胞[20]内质网应激的产生；游离脂肪酸通过CHOP通路促进小鼠足细胞内质网应激的激活[21]。内质网应激诱导的心肌细胞凋亡在DCM的发生发展中发挥重要作用。Li等[22]发现，链脲佐菌素诱导小鼠心肌组织CHOP、GRP78、GRP94、激活型ATF6及磷酸化α 亚基的真核起始因子2表达均明显增加，进一步证实了内质网应激在DCM发展过程中的重要作用。体外研究证实，高糖可以通过激活氧化应激诱导心肌细胞内质网应激的产生，进而促进心肌细胞凋亡[23]。

本研究显示，给予高糖刺激后，心肌细胞中尾加压素Ⅱ及其受体表达明显增加，内质网分子伴侣GRP78、转录因子ATF6、内质网相关凋亡信号分子CHOP、caspase-12的表达均明显增加，而尾加压素Ⅱ受体拮抗剂Urantide可以部分阻止这一过程，提示高糖刺激下尾加压素Ⅱ可能通过与其特异性受体结合，激活氧化应激、内质网应激通路，进而促进心肌细胞凋亡。

综上所述，尾加压素Ⅱ除了具有较强的血管活性外，还可以在高糖刺激下表达增加，进一步激活氧化应激、内质网应激及细胞凋亡通路，从而参与DCM的发病过程。本研究结果丰富了DCM的病理生理学机制，为糖尿病并发症的防治提供了新思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突