干血片毛细血管电泳技术在新生儿α-地贫筛查中的应用

姚 靖 刘恩赐 李肖妹 张炜羡 黄晓凌

(广东省阳江市妇幼保健院 阳江 529500)

地中海贫血(以下简称地贫)是一种常见的遗传性溶血性贫血，根据编码α和β肽链的基因缺失或突变情况，可分为α-地贫和β-地贫[1]。我国是α-地贫的高发地区，其中广东省α-地贫的发病率高居全国第二[2]。因此，早期筛查本地区新生儿α-地贫发病意义重大。对于静止型的阳性患儿，可建立终身可查的电子健康档案，进行有效的遗传咨询和健康教育，避免其孕育中间型地贫下一代；对轻、中型地贫患儿来说，早期筛查发现并定期进行追踪和发育评估，可提高儿童智力和生长发育水平，避免重型患儿的出生。近年来，有学者提出可将滤纸干血片全自动毛细管血红蛋白电泳分析技术应用到新生儿地贫的筛查[3]。本研究通过收集阳江市新生儿滤纸干血片标本，探究滤纸干血片毛细管电泳技术检测的应用效果，为本地区新生儿α-地贫的预防、临床诊断、遗传咨询提供参考资料。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月～2019年12月阳江市妇幼保健院及阳江市各助产机构送检的新生儿滤纸干血片标本23 769例，其中男12 687例，女11 082例。

1.2 滤纸干血片制备方法

于新生儿出生2～7d后从足跟内或外侧采血，滴于专用采血滤纸上，要求血斑直径>8mm，且从正面渗透至背面，每例采集血斑3个，将血斑滤纸置于通风处自然晾干，再密封于塑料袋，2℃～8℃下保存，5d内以快递形式送至阳江市新生儿筛查中心检测。

1.3 检测方法

钳取直径为3.8mm的血斑，置于加有蒸馏水的样品杯孔中，再放入湿盒于4℃下洗脱2～72h；采用capillarys2 neonat fast全自动干血片毛细管电泳仪及其配套电泳试剂盒(法国Sebia公司)，对样品进行血红蛋白电泳检测，测定正常血红蛋白和主要变异体的含量。同时，对筛查阳性新生儿及时召回做地贫基因检测。

1.4 筛查结果判读及基因诊断[4]

α-地贫筛查阳性判断标准：Hb Bart's≥0.1%判定为α地中海贫血筛查阳性。采用PCR+倒流杂交法，分析α-地贫筛查阳性新生儿α-地贫基因常见的缺失突变，包括-α3.7、-α4.2、--SEA、 Hb CS、Hb QS和Hb WS。基因诊断标准：缺失或突变1个α基因为静止型，缺失或突变2个α基因为标准型，缺失或突变3个α基因为中间型，缺失或突变4个α基因为重型。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 α-地贫的筛查结果

23 769例滤纸干血片标本中检出Hb Bart's阳性2 825例，阳性率为11.89%，共召回1 068例进行PCR地贫基因诊断。

2.2 α-地贫的基因诊断结果

召回初筛阳性1 068例，确诊阳性998例，确诊符合率为93.45%，具体基因类型分布情况见表1。基因诊断结果显示，静止型338例，标准型635例，中间型25例，重型0例，标准型中以基因型--SEA/αα常见。

表1 新生儿α-地贫基因诊断结果

2.3 初筛Hb Bart's含量与临床表型的关系

不同临床表型患儿Hb Bart's水平比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；其中中间型患儿Hb Bart's水平高于标准型和静止型(q=69.086、82.829，P<0.001)，且标准型患儿Hb Bart's水平高于静止型(q=45.759，P<0.001)，见表2。

表2 临床表型和Hb Bart's水平关系

3 讨论

地中海贫血是全世界许多国家都关注的重要遗传性疾病，由于地中海贫血基因携带者婚配可使下一代有1/4的机会患中、重型地中海贫血，故可严重影响高发区的人口质量。在我国，该病主要在长江以南大部分省区，特别是广西、广东和海南等省区流行。α-地贫严重情况下具有较高的致残、致死性，而携带地贫基因的轻型患者，容易在新生儿和儿童时期出现溶血性黄疸、贫血等症状，影响儿童生长发育[5]。通过产前筛查技术可以预防重型患儿的出生，因此，早期筛查在地贫的预防及后期诊疗中有重要临床意义。

目前，新生儿地中海贫血筛查最为简便、有效的方法是毛细胞血红蛋白电泳技术，很多医院采用脐带血进行早期筛查，但脐血标本容易混进母体血，可能无法准确反应新生儿的血红蛋白情况，而且脐血的保存、运送要求较高，无法满足分散于本市其他助产机构的集中送检。同时，脐血筛查地贫存在漏筛静止型α-地贫的可能性[6]。另外成人的产前地贫筛查与地贫基因符合率低[7]，究其原因是HbBart's只特异性地存在于新生儿期，3个月后自然消失，成人地贫筛查未能有效筛查出静止型α-地贫，静止型α-地贫基因携带者与同型地贫基因携带者婚配生育，每次生育有1/4的概率怀上中间型地贫胎儿。近年来，滤纸干血片全自动毛细管血红蛋白电泳分析技术逐渐应用于新生儿地贫的早期筛查，该技术是利用高电压，使得新生儿滤纸干血片中的微量血红蛋白组分分离，从而准确测定各种血红蛋白组分的含量[8]。与脐带血比较，滤纸干血片具有更易长期保存，运输方便，对新生儿创伤小，且可与传统的新生儿筛查项目同时检测等特点。

本研究利用毛细管电泳技术检测23 769例滤纸干血片标本，检出Hb Bart's阳性2 825例，阳性率为11.89%，高于文献报道广东省中山市新生儿α-地贫初筛携带率5.31%[9]，考虑差异因素有：(1)不同地区α-地贫携带率具有特异性；(2)文献选用检测样本为脐带血，可能出现假阴性。根据初筛结果，召回1 068例新生儿作进一步基因型检测，确诊阳性998例，确诊符合率为93.45%，与文献报道基本相符[10]。提示干血片毛细血管电泳技术对于新生儿α-地贫筛查具有较高的应用价值，完全可满足筛查需求[11～13]。另外，分析患儿Hb Bart's水平与临床表型的关系发现，中间型患儿Hb Bart's水平高于标准型和静止型，且标准型患儿Hb Bart's水平高于静止型，进一步说明临床可根据Hb Bart's水平初步划分α-地贫患儿临床表型，对后期基因确诊有一定指导意义。

综上所述，利用干血片毛细血管电泳技术定量分析Hb Bart's水平，对新生儿α-地中海贫血的筛查准确性高，且干血片标本的运输、保存也更为便捷，对于新生儿疾病筛查的广泛开展有积极意义。