金黄色葡萄球菌的表型药物敏感性与耐药基因携带性的相关分析

于美美，王佳齐，顾增辉，吴湘艳，沈兰东，庄龙其，李倩

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)存在于皮肤和软组织感染、败血症等感染性疾病。目前SA耐药情况严重，耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)治疗非常困难[1]。细菌携带的耐药基因与耐药性有一定相关性，对耐药菌株的检测有一定辅助作用。为了解SA耐药与基因携带性的关系，指导临床合理用药，本研究对分离的SA菌株86株进行表型药物敏感性和耐药基因携带性的相关分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：选取2015年8月-2016年5月潍坊医学院附属医院检验科分离出的非重复SA菌株86株。

1.1.2 主要试剂及仪器 EasyTaq® DNA Polymerase和EasyPure® Bacteria Genomic DNA Kit购自北京全式金公司，全自动微生物鉴定药敏试验分析仪VITEK 2-Compact和鉴定卡VITEK® 2 AST-GP67购自法国生物梅里埃公司，PCR扩增仪Applied BiosystemsTMVeritiTM96-Well Thermal Cycler购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 观测指标与方法

1.2.1 菌株鉴定与药敏试验：全自动微生物分析仪用于菌株鉴定及药敏试验，药敏试验结果参考CLSI 2014标准[2]。质控菌株为SA ATCC 29213。MRSA指对苯唑西林耐药[最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)≥4 μg/ml]或头孢西丁耐药(抑菌圈直径≤21 mm或MIC≥8 μg/ml)的SA[2]。

1.2.2 耐药基因检测：取过夜培养的菌液1 ml离心去上清，加入EasyPure® Bacteria Genomic DNA Kit试剂盒中的RB11 200 μl和溶葡萄球菌素(10 mg/ml)10 μl重悬，37 ℃温育1 h，再用试剂盒提取基因组。在华大基因进行耐药基因片段的引物合成(表1)，使用相应引物对每株SA的基因组分别进行PCR扩增，扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环30次；72 ℃ 10 min。PCR阳性片段在北京睿博兴科生物技术有限公司测序，使用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行DNA序列比对，测序片段序列与数据库中该基因序列符合者纳入统计范围。耐药基因PCR扩增相应引物见表1。

表1 耐药基因PCR扩增相应引物

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。应用WHONET 5.6对药敏试验结果进行统计。耐药率比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 标本及科室分布

2.1.1 患者临床资料分布构成比：患者中男性患病率略高于女性，18～60岁患者最多，标本主要来源于分泌物、脓液和痰。见表2。

表2 患者临床资料分布构成比

2.1.2 科室分布：SA菌株多分布在儿科、关节外科、ICU和皮肤病科等。见表3。

表3 86株SA的科室分布

2.2 菌株耐药情况

图1 86株SA药敏试验结果

表4 MRSA与MSSA耐药情况比较

2.3 相关耐药基因检测情况

表5 SA耐药基因检测结果

注：M为DNA marker；a：泳道1为blaZ，2为tetM，3为msrA，4为qacA；b：泳道1为mecA，2为dfrG，3为tet38；c：泳道1为msrB，2为tetK，3为aac(6′)aph(2″)，4为ermB，5为qacC；d：泳道1为ermA；e：泳道1为ermC

2.3.2 MRSA和MSSA耐药基因检测结果：MRSA中mecA、tetK和tetM基因检出率大于MSSA(P<0.05)，MRSA中最常见的四种耐药基因携带谱blaZ+msrA+msrB+tet38占73.91%。见表6。

3 讨 论

表6 MRSA和MSSA耐药基因检测结果

环境对基因表达的影响使得SA对某些抗生素的表型耐药性和耐药基因携带性之间的相关性不高，因此分子生物学方法只能作为辅助诊断工具。本研究中检出的MRSA除对苯唑西林、青霉素完全耐药外，对红霉素、克林霉素、四环素的耐药率均>60%，说明MRSA除对β-内酰胺类抗生素耐药之外，对大环内酯类、林克酰胺类、四环素类抗生素也具有一定耐药性。MRSA对3种及3种以上抗生素耐药的菌株占95.65%，表现出多重耐药的特征，可能与MRSA携带多种耐药基因有很大关系。MRSA最常见的耐药基因谱为blaZ+msrA+msrB+tet38，且23株MRSA均含有不等数目的耐药基因，有1株MRSA携带12种耐药基因，这要求今后临床用药更加谨慎[7]。

综上所述，本地区SA表现出多重耐药的特征，且与部分耐药基因密切相关，治疗时应根据药敏试验结果合理选用抗生素进行治疗。