可食性褐藻纤维素的分离纯化与结构分析

杨贺棋，何沁峰，董秀瑜，周 新，李欣蔚，赵梓印，周 慧，何云海，汪秋宽，武 龙

(大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023)

大型海藻被认为是一种开发潜力巨大的“碳平衡”可再生生物资源，已受到全球广泛关注[1]。联合国粮农组织统计显示，世界海藻总产量在2010～2015年间增长了52.1%，其中大型褐藻占到总产量的36.5%[2]。我国是世界第一大经济海藻及可食性褐藻生产国。与FAO统计基准不同[3]，2017年我国大型褐藻海带及裙带菜养殖产量分别达148.7万t和16.7万t，合计占到当年海藻养殖总产量的74.2%，且近5年二者合计产量的增幅达39.2%，产业发展势头强劲[4]。

纤维素由D-葡萄糖单元经β-(1→4)糖苷键聚合而成，作为细胞壁骨架成分广泛存在于陆生及海洋植物当中。褐藻细胞壁具有双层结构，其外层为褐藻胶与硫酸化岩藻多糖组成的无定形基质；而纤维素作为内层纤维状骨架嵌入其中，赋予细胞壁结构强度[5]。纤维素含量一般占褐藻干质量的2%～20%，仅次于褐藻胶而居多糖类物质的第二位[6]。除供食用外，海带等大型褐藻还是工业提取褐藻胶等有价值化学品的原料，纤维素在提胶残渣中得到富集，含量可达藻渣的42%[7]。从生物炼制的角度出发，褐藻纤维素因不受木质素、半纤维素等拮抗性成分的保护，在可及性、功能性及综合利用可行性方面均具有潜在的优势[8]。

纤维素是植物源不溶性膳食纤维的核心成分。最近，微粒化纤维素(微米或纳米尺度)的体外功能特性与体内降低血脂、调节血糖等生理活性已得到报道[9-11]。目前，不溶性膳食纤维相关研究普遍关注其功能评价与应用研发，而纤维素的结构属性对理化性质与功能特性的影响及其调控机制仍有待深入研究。在海洋源健康食品得到产学研各方及消费大众日益关注的背景下，本研究以我国主要食用经济褐藻海带和裙带菜为对象，着眼纤维素的分离纯化与结构分析，以期为优质膳食纤维资源的开发以及褐藻精深加工与资源综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带(Saccharinajaponica)、裙带菜(Undariapinnatifida)，养殖于大连附近海域(旅顺柏岚子养殖场，38°45′22.0″N 121°13′13.5″E)，收获于2017年5月，由养殖企业提供，洗净自然风干后室温密闭贮存备用。

纤维素(Sigmacell Type 101)、微晶纤维素(Avicel PH-101)，美国Sigma-Aldrich公司；铜乙二胺(1 mol/L水溶液)，美国Acros Organics公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GL-21M型高速冷冻离心机，长沙湘仪仪器离心机有限公司；Scientz-10N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；乌氏黏度计(毛细管孔径0.5 mm)，上海申谊玻璃制品有限公司；3 L单罐型球磨机，宜兴市丁蜀浩强机械厂；1260 Infinity型高效液相色谱仪(配备紫外-可见光检测器)，美国Agilent公司；Venusil XBP-C18型色谱柱，美国Phenomenex公司；Nicolet iS50型傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；X’Pert Pro MPD型粉末X射线衍射仪，荷兰PANalytical公司；Jade 6.0版X射线衍射数据分析软件，美国MDI公司。

1.3 实验方法

1.3.1原料预处理

干燥海带与裙带菜原料分别用小型粉碎机粉碎，过60目筛，密封保存于干燥器中备用。

1.3.2基本成分测定

水分测定：直接干燥法[12]。总灰分测定：高温灼烧法[13]。粗蛋白含量测定：凯氏定氮法[14]。粗脂肪含量测定：索氏抽提法[15]。

海带中甘露醇质量分数采用分光光度法进行测定[16]；褐藻胶质量分数(以褐藻酸钠计)采用质量法进行测定[17]。

1.3.3褐藻纤维素提取

海带或裙带菜粉末在室温下以甲醇浸泡12 h，过滤；滤渣用去离子水洗涤后用乙酸调节pH值至2～3后，加入适量亚氯酸钠，于通风橱内60 ℃下搅拌处理3 h，洗涤、过滤至滤液呈中性。滤渣于0.5 mol/L氢氧化钠溶液中60 ℃搅拌处理6 h，洗涤、过滤至滤液呈中性。然后滤渣置于1.5 mol/L盐酸溶液中煮沸，静置12 h，洗涤、过滤至滤液呈中性。最后将所得滤渣以叔丁醇离心洗涤3次后冷冻干燥，密封贮存备用[18]。

1.3.4褐藻纤维素理化性质分析

1.3.4.1 基本成分测定

按1.3.2方法对从2种褐藻中提取的纤维素的基本成分进行测定。提取样品的总固形物、总可溶性固形物含量参考美国可再生能源国家实验室(National Renewable Energy Laboratory，NREL)方法进行分析[19]。

1.3.4.2 葡聚糖质量分数测定

采用硫酸分步水解—高效液相色谱法对所提取纤维素样品的葡聚糖质量分数进行分析[20]。

硫酸分步水解：取100 mg样品于消化管内，加1 mL质量分数72%硫酸，25 ℃水浴下玻璃棒搅拌反应1 h，加水稀释至硫酸质量分数为3%，密闭管盖后置于高温灭菌锅内，121 ℃下反应60 min，冷却后适当稀释并用碳酸钙中和，离心取上清液(水解液)待测。葡萄糖作为硫酸分步水解对照组用以修正第二步水解过程中单糖的损失。

高效液相色谱分析：配置一定浓度梯度的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖标准溶液。取200 μL标准溶液或水解液样品，以0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-甲醇溶液于70 ℃衍生处理90 min，随后去除有机相并取水相样品进行高效液相色谱分析[21]。分析条件为柱温30 ℃，流速1 mL/min，检测波长250 nm；流动相A为体积分数15%乙腈水溶液(含50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液，pH值6.0)，流动相B为体积分数40%乙腈水溶液(含50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液，pH值6.0)；洗脱梯度如表1。

表1 高效液相色谱分析流动相洗脱梯度

水解液单糖质量分数根据浓度-色谱峰面积标准曲线求算。样品葡聚糖质量分数按式(1)计算：

(1)

式(1)中，m(水解液中葡萄糖)、m(水解前样品干质量)，g。

1.3.4.3 红外光谱分析

将纤维素样品用球磨机研磨粉碎，过200目筛，以1∶100质量比与溴化钾混合于玛瑙研钵中研磨均匀，压片，置于傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)仪样品槽中，在波数400～4 000 cm-1以透射模式进行分析，扫描次数32次，分辨率为0.5 cm-1。

1.3.4.4 聚合度分析

采用铜乙二胺黏度法对所提取纤维素样品的固有黏度进行分析，进而根据式(2)计算样品平均聚合度(degree of polymerization，DP)[22]：

DP0.85=1.1×η。

(2)

式(2)中，η为样品固有黏度，Pa·S。

1.3.4.5 粉末X射线衍射分析

将纤维素样品均匀填满X射线衍射仪样品槽中，以Cu Kα射线(λ=0.154 2 nm，发生于50 kV、300 mA)进行分析，在散射角度2°～60°以0.02°分辨率测定衍射强度，扫描速度2°/min。根据衍射图谱(衍射强度对衍射角绘图)，按式(3)计算样品的结晶度指数(crystallinity index，CrI)[23]。

(3)

式(3)中，Ic为结晶性区域的衍射强度，在图谱最高峰(衍射角2θ≈21.8°)处取得；Ia为无定型区域衍射强度，在2θ为18.0°附近的波谷处取得。

进而在Jade 6.0分析软件中使用pseudo-Voigt函数对10～30°的衍射图谱进行拟合分析，以获得不同晶面衍射峰的衍射角2θ、半峰全宽(full width at half maxima，FWHM)等参数[24]。根据拟合所得数据，运用谢乐(Scherrer)公式[式(4)]以及布拉格(Bragg)定律[式(5)]，计算结晶结构的晶粒尺寸与晶面间距[25]。

L=0.9×λ/(H×cosθ)；

(4)

d=n×λ/(2×sinθ)。

(5)

式(4)、式(5)中，L为垂直于晶面方向的晶粒尺寸，nm；λ为X射线波长，nm；H为FWHM，rad；θ为掠射角，rad；d为晶面间距，nm；n为正整数。

1.4 数据处理

数据用SPSS 19.0软件进行统计学处理及显著性分析(P<0.05),并以3次平行实验测定的平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 褐藻纤维素分离纯化结果

海带和裙带菜原料的基本成分如表2，数据与文献报道结果相符[26-29]。作为我国乃至东亚地区主要食用褐藻种类，二者均含有丰富的碳水化合物、矿物质及蛋白质，属于低能量、高膳食纤维的“健康”食品材料。2种原料均富含褐藻胶，直接食用可提供丰富的可溶性膳食纤维，海带因其褐藻胶含量更高且产量大也被用作工业提胶原料。二者的矿物质含量均较高，且裙带菜显著高于海带；据报道矿物质主要以藻酸盐的形式存在于细胞壁中，主要包括钾、钠、钙等碱及碱土金属元素[28，30]。裙带菜样品的粗蛋白含量显著高于海带。海带中则含有更多的甘露醇。此外2种海藻的脂类物质含量均较低。

表2 海带及裙带菜样品的基本组成

为了有效分离褐藻纤维素，确保其纯度及提取率，本研究针对样品成分特点设计了多步提取及纯化路线。海带及裙带菜原料经过洗涤，脱色，酸、碱处理，冷冻干燥后，均得到具有疏松结构的白色纤维状物质。提取物经硫酸分步水解后，其水解液样品的高效液相色谱洗脱曲线均仅有1个特征峰，对照标准品保留时间判定为葡萄糖，见图1。通过标准曲线计算可知，2种样品中葡聚糖质量分数分别达(99.86±2.12)%及(98.91±3.45)%(以干质量计，n=3)。因提取物的可溶性物质含量极低(小于0.04%)，可见原料中的“杂质”成分得到了有效去除，所提取物质为高纯度不溶性葡聚糖。对2种提取样品及市售纤维素试剂进行FT-IR分析，如图2。可见3种样品具有高度一致的红外吸收图谱，表明其具有一致的化学组成与基本结构。一定波数处的特征峰及其官能团归纳见表3，对照文献报道结果[7]，可见提取自2种褐藻的样品均具有典型纤维素特征吸收。以上定量与定性分析结果表明，所提取物质均为高纯度纤维素。经测定，海带纤维素的灰分质量分数为(0.93±0.09)%，裙带菜纤维素灰分质量分数为(1.02±0.34)%；海带与裙带菜纤维素的提取率分别为原料干质量的5.59%及2.61%。

表3 3种纤维素样品FT-IR特征吸收比较

图2 3种纤维素样品FT-IR分析

作为细胞壁的骨架成分，纤维素赋予其结构强度进而发挥支撑与保护细胞的作用。海带较高的纤维素含量与其相对坚韧的质地相符；而裙带菜的纤维素含量较低，质地更加柔软。据报道用于提取褐藻胶的大型褐藻原料，如巨藻(Macrocystispyrifera)，其纤维素含量可达8.14%，已不适于食用[31]。本研究结果也表明：作为我国主要可食性褐藻，海带和裙带菜除含有丰富的可溶性膳食纤维外，还可以提供一定量的不溶性膳食纤维，而海带的不溶性膳食纤维含量相对较高。

2.2 褐藻纤维素结构分析

2.2.1分子结构

成分分析表明，提取的褐藻纤维素的纯度较高，其酸水解产物为单一葡萄糖。纤维素的聚合度指分子链中所连接的葡萄糖单元的数目，聚合度对纤维素理化性质有着重要的影响[9,32]。本研究采用黏度法测定了海带及裙带菜纤维素样品的平均聚合度，结果如表4。在本实验条件下制备所得海带纤维素的聚合度远高于裙带菜纤维素；而所得2种褐藻纤维素的聚合度均显著低于高等植物来源纤维素。有报道指出，纤维素的聚合度对其持水能力(膳食纤维的重要理化指标之一)具有显著影响，但对持水能力变化规律与影响机制的研究尚不充分[9]。另一方面，添加富含纤维素的高等植物不溶性膳食纤维会对食品的感官品质、稳定性及加工特性带来一定的负面影响[33-34]。可见，褐藻所含相对“短链”纤维素值得在不溶性膳食纤维强化食品研发中得到更多关注。

表4 3种纤维素样品的聚合度

2.2.2聚集态结构

天然纤维素的直链葡聚糖结构使其易于通过分子内及分子间氢键形成致密有序的结晶结构，从而呈现较清晰的X射线衍射图谱。纤维素的聚集态结构是指纤维素分子间的相互排列情况(晶区和非晶区、晶胞大小及形式、分子链在晶胞内的堆砌形式等)。结晶区与无定形区的比例、结晶的完善程度，均随纤维素的种类而异。事实证明，超分子结构是影响纤维素性能的直接因素，既包括其作为高分子材料的使用性能，也涉及其作为膳食纤维的功能特性。

2.2.2.1 结晶程度

本研究中4种纤维素样品的X射线衍射图谱(衍射强度随衍射角的变化)见图3，其中微晶纤维素是天然纤维素通过强酸水解去除部分无定形区后的产物。由图3可知，海带、裙带菜及微晶纤维素的主要衍射峰峰型较为尖锐，分离度较高，体现出更加有序的结构；而所有样品均呈现出天然纤维素的I型结晶结构[18]。结晶性区域占纤维素整体的百分比被定义为结晶度，对于I型结晶结构可以通过式(3)求算结晶度指数进行评价。4种样品的CrI值计算结果如表5。除市售纤维素(Sigmacell Type 101)外，其他3种样品的CrI值均大于70%，说明其中结晶性区域占比较高，整体结构更加有序。值得注意的是2种褐藻纤维素在未经进一步处理的情况下结晶度指数与市售微晶纤维素接近；这一结果也高于大多数文献报道的高等植物来源纤维素[9,35-36]。纤维素结晶程度对于其悬浮与乳化稳定性、热稳定性与水合能力具有显著影响，但其作用机制还有待进一步研究确认[9]。此外，研究结果也表明：以褐藻纤维素为原料制备微晶或纳米结晶纤维素，有望简化工艺，降低制备过程强度并提高产物得率与产品性状。

图3 4种纤维素样品的X射线衍射图谱

表5 4种纤维素样品的结晶指数

2.2.2.2 多晶型结构

氢键排布的不同使纤维素具有多晶型结构。在天然纤维素Ⅰ型结晶结构中存在2种相互伴生的晶型，即Ⅰα型(单链三斜晶系)和Ⅰβ型(双链单斜晶系)，二者的比例与纤维素的来源密切相关[37]。通过对X射线衍射数据进行深入分析，可以获取其晶体结构的详细信息。本研究首先在数据分析软件中使用pseudo-Voigt函数对10～30°的衍射图谱进行了峰型拟合分析，获取了2种晶型4个主要晶面衍射峰的衍射角、半峰全宽等关键参数(见表6)。拟合结果见图4及表7，拟合误差小于一般要求的9%[38]。其中市售纤维素(Sigmacell Type 101)因结晶程度较低，衍射峰分离度较差，晶面c已无法拟合。

表7 4种纤维素样品X射线衍射图谱峰型拟合所得参数

图4 4种纤维素样品X射线衍射图谱峰型拟合结果

表6 不同晶面X射线衍射峰的峰型拟合分析

根据拟合所得参数，运用谢乐公式以及布拉格定律，求得各样品的晶粒尺寸与晶面间距，计算结果如表8。海带、裙带菜纤维素在晶面d垂直方向的晶粒尺寸相当，略小于微晶纤维素，而远大于市售纤维素，也印证了此取向上晶粒尺寸与晶体结构完整度正相关的观点[25]。据报道晶粒尺寸对纤维素的理化性质也具有影响，热稳定性随晶粒尺寸减小而降低[39-40]。晶粒尺寸对纤维素膳食纤维功能特性的影响尚未见报道。2种褐藻纤维素样品晶面间距计算结果高度一致，且在晶面a、b方向上显著区别于高等植物纤维素样品，与文献报道结果相符[40]，也体现出晶胞空间结构上的差异。Wada等[41]提出了判断纤维素多晶型结构的经验公式[式(6)]，并已得到广泛应用。

Z=1 693da-902db-549。

(6)

式(6)中，Z为晶系判别系数，当Z>0时结晶结构以Iα型为主，Z<0时以Iβ型为主；da及db分别为计算所得晶面a与晶面b所对应的晶面间距(nm)。计算结果(表8)表明海带和裙带菜纤维素的Z值均为正值，显示其结晶结构以Iα晶型为主，而2种市售纤维素的Z值均为负，表明其中Iβ晶系占主导。有研究指出，Iα构型较Iβ构型在热力学上更加不稳定[42]，更易于参与生化反应[43]。海带和裙带菜所含不溶性膳食纤维的独特结构与其相关功能特性的内在联系有待进一步研究。

表8 4种纤维素样品的晶粒尺寸、晶面间距及Z值计算结果

3 结 论

本研究以我国主要可食性褐藻海带和裙带菜为原料，通过多步分离纯化工艺，在相对温和的处理条件下提取褐藻纤维素。结果表明：提取的纤维素具有较高纯度，而海带的纤维素含量明显高于裙带菜。海带纤维素的聚合度明显高于裙带菜，但二者均显著低于高等植物纤维素。通过粉末X射线衍射分析，对褐藻纤维素的超分子结构进行了研究。结果显示：2种褐藻纤维素均具有天然高度结晶性结构，其结晶度指数达到市售微晶纤维素的水平，明显高于多数陆生高等植物纤维素。所提取褐藻纤维素具有典型I型结晶结构，且其基本结构单元以单链三斜晶系为主，显著区别于陆生高等植物。鉴于可食性褐藻所含不溶性膳食纤维的独特结构，其理化性质以及在营养健康与食品加工方面的功能特性值得食品科技领域更多研究关注。本研究结果旨在为优质膳食纤维资源的开发以及我国经济褐藻资源的高效率、高值化、可持续利用提供理论参考。