Wnt信号通路与无脊椎动物天然免疫

邹晨辰 阮灵伟 施泓

（自然资源部第三海洋研究所 自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室，厦门 361005）

Wnt信号通路最早在果蝇的发育中被发现，它在动物间存在遗传学上的高度保守性，且存在于所有后生动物中［1］。该信号通路广泛参与细胞增殖和凋亡、组织分化和再生、胚胎发育等多种生物过程［2］。目前，Wnt信号通路在多种疾病发生和发展中的作用，以及在病原体侵染时发挥的天然免疫调控作用正成为研究热点。

Wnt信号通路以Wnt为配体激活信号通路，从而将胞外信号传入胞内。根据Wnt的分子类型和下游分子的响应作用机制，Wnt信号通路可分为2类，即经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路。经典Wnt信号通路目前已被广泛研究，随着研究的深入非经典Wnt信号通路也正越来越多地引起人们的关注。其中非经典Wnt信号通路主要包括Wnt/平面细胞极性信号通路（Wnt/planar cell polarity pathway，Wnt/PCP pathway）和 Wnt/Ca2+信号通路［3］。

1 经典Wnt信号通路

1.1 经典Wnt信号通路概述

经典Wnt信号通路，也称Wnt/β-catenin信号通路，是最早发现的Wnt信号通路，因此被称为经典Wnt信号通路。它最大的特点是由该通路的关键分子β-catenin来介导。

在正常状态下，Wnt信号通路处于关闭状态。细胞质中的β-catenin被由支架蛋白Axin、腺瘤息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、糖原合酶激 酶 -3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）和 酪蛋白激酶1（casein kinase1，CK1）等蛋白组成的降解复合体磷酸化后，被β-转导素重复序列包含蛋白（β-transducin repeat containing protein，β-TrCP）泛素化［4］。随后，泛素化的β-catenin被蛋白酶体识别并快速降解，在细胞中维持较低水平［5］。而这时在细胞核中，T细胞因子/淋巴样增强因子（T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）与共阻遏因子Groucho（人类中同源蛋白为TLE）结合，并募集去乙酰化酶如 HDAC1（果蝇中为Rpd3），催化靶基因区域组蛋白去乙酰化，从而抑制靶基因表达［6-7］。除了Groucho外，Dact1、Osa、Mtgr1、TIS7和CtBP等分子也参与靶基因表达的抑制过程［8］。

当受到外界刺激（如损伤、病原体、激动剂等）时，Wnt蛋白与细胞膜上的两种跨膜蛋白——Frizzled家族受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related proteins5/6，LRP5/6）（果蝇中同源物为Arrow）的胞外结构域结合后，形成Wnt-Frizzled-LRP5/6三聚体复合物，激活Wnt信号通路［9-14］。其中，Frizzled通过Disheveled（Dvl）的PDZ和DEP结构域募集并磷酸化Dvl。磷酸化的Dvl通过DIX同源结构域相互作用，将Axin募集到质膜上［15-16］。此外，由于GSK- 3和CK1与支架蛋白Axin存在互作，因此一起被募集到质膜上。LRP5/6胞质区包含保守的5个PPPSPxS基序，在Wnt刺激后PPPSP被GSK-3磷酸化，xS被CK1磷酸化。磷酸化的5个PPPSPxS基序同时为Axin分子提供结合位点，导致Axin去磷酸化降解。此外，Wnt刺激也会导致GSK-3的活性受到抑制，但其具体机制仍存在争议［14］。Axin、GSK-3和CK1的膜转移导致APC从降解复合体中分离，并使降解复合体解聚，因此 β-catenin 的降解被抑制［11，17］。稳定的β-catenin在细胞质中积累并在Twa1的作用下转移至细胞核，取代Groucho并与BCL9、Pygopus、CREB结合蛋白等转录共激活因子形成复合物，同时与TCF/LEF转录因子结合，使TCF/LEF从抑制状态转变为激活状态，以细胞特异性方式启动下游靶基因如cyclinD1、c-myc和metalloproteinase的转录，进而诱导后续细胞反应的发生［18-21］。

虽然以上经典模型已被普遍接受，但对于降解复合体是如何被Wnt信号调节的仍存在很大争议。Lybrand等［22］认为Wnt刺激改变了降解复合体的构象而导致其失活。也有报道称β-catenin泛素化失败是Wnt信号通路激活的主要事件。Wnt与其受体的互作并不改变降解复合体的组成，且不影响其激酶活性，甚至β-catenin仍然与降解复合体结合，而唯一的变化是β-TrCP从降解复合体中解离。因此，β-catenin不再被泛素化和降解，从而使Axin达到饱和［23］。此外，TCF/LEF由抑制状态转变为激活状态也有多种模型［8］。有研究表明，β-catenin也可以不依赖TCF/LEF转录因子，而是由Oct-4等作为下游转录因子来调节靶基因的转录［24-25］。针对不同应答，Wnt信号通路可能有不同的调节方式。以上都体现了经典Wnt信号通路的复杂性。

1.2 经典Wnt信号通路主要成员

1.2.1 Wnt Wnt是一类疏水性分泌型糖蛋白，由果蝇中的 Wingless（Wg）基因和小鼠中同源基因Int共同命名［26］。自1982年Nusse首次从小鼠乳腺癌中克隆出Wnt基因以来，目前已从不同物种中分离出许多Wnt基因，由这些基因组成Wnt家族［27］。哺乳动物基因组中存在19个Wnt基因，分为12个亚家族。节肢动物中，果蝇的Wnt基因研究最为全面，它有7个Wnt基因，而凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）则有12个Wnt基因亚家族。有趣的是，Wnt3在哺乳动物中不存在，而WntA在节肢动物中不存在［28］。

Wnt蛋白含有350-400个氨基酸，其中包括22或24个保守的半胱氨酸残基，这些残基通过11或12个分子内二硫键的形成对蛋白质进行适当折叠，这对Wnt蛋白的内源性疏水很重要［28-29］。新合成的Wnt在内质网中被Porcupine（PORCN）棕榈酰化，之后被转运蛋白Wntless释放到胞外。Wnt蛋白在Wnt信号通路中起配体的作用，其通过分泌作用与细胞膜上受体结合来激活Wnt信号通路。在个体不同生长、发育阶段和免疫应答中Wnt基因有不同的表达模式，并且不同的Wnt蛋白可以与相同的受体发生不同的相互作用［18］，这也为Wnt信号通路的多样化提供了条件。许多Wnt信号通路的抑制分子可通过拮抗Wnt来抑制Wnt信号通路，包括Dkk1、sFRP1-5、Wif1、Cerberus、Wise/SOST 和 Dickkopf家族蛋白［30-31］。

1.2.2 β-catenin Armdillo蛋白家族成员β-catenin是Wnt经典信号通路最为关键的信号转导因子，起枢纽作用。β-catenin最先在1990年作为哺乳动物细胞黏附复合体被发现，它可与钙黏蛋白（cadherin）相互作用，参与细胞黏附和构成细胞骨架组织，即它还具有结构功能［32-33］。在大多数动物物种中，结构功能和信号传导功能由一种β-catenin行使。然而在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，由不同种类的β-catenin分别行使这两种功能［34］。有研究发现，β-catenin参与黏附或Wnt信号通路是由其分子形式所决定的，而不是简单的TCF/LEF和cadherin对一种分子形式β-catenin的竞争［35］。

果蝇中β-catenin的同源物叫Armadillo，人类中叫CTNNB1。β-catenin的特征结构域有：N末端、中 间 12个 连 续 的 Armadillo/β-catenin-like（ARM）重复域、C末端［34］。其中，N末端富含Ser/Thr残基，含有保守的GSK-3及CK1磷酸化位点，控制着β-catenin的稳定性。ARM重复域被证明可以与多种蛋白质结合，如TCF/LEF、ICAT、Axin、APC、E-cadherin等，是β-catenin的核心区域。ARM重复域的晶体结构表明，每个ARM重复由3个螺旋组成，分别为H1、H2、H3［36］。C末端为转录激活区域，可与IRF3等转录因子结合促进转录的起始和延伸［37-38］。β-catenin的这些保守结构域与它在经典Wnt信号通路中的核心作用是密不可分的。经典Wnt信号通路激活时，β-catenin在细胞质内积累并入核，细胞核内的β-catenin与TCF/LEF结合调节下游靶基因的转录。而当信号通路闭合时，β-catenin在细胞质内被大量降解而失活。

1.2.3 降解复合体 降解复合体由Axin、APC、GSK-3、CK1等蛋白组成。降解复合体在Wnt信号通路中通过调节关键分子β-catenin的磷酸化水平来调控信号传导。在Wnt信号通路闭合时，细胞质中的降解复合体将β-catenin磷酸化来促进β-catenin的降解。而当Wnt信号通路激活时，降解复合体失活，β-catenin不能被磷酸化而在胞质中大量积累。因此，降解复合体是Wnt信号通路的关键负调控因子。

1.2.3.1 Axin Axin参与代谢、神经系统发育、肿瘤发生发展等多种过程［39］。Axin蛋白的N端和C端分别包含一个RGS结构域和一个DIX结构域。RGS结构域与APC结合，DIX结构域与Dvl结合。Axin中心区域包含了β-catenin、GSK-3、CK1等许多蛋白相互作用的位点。

Axin通过介导多种信号复合物的形成，在多种信号通路中发挥重要作用，如Wnt/β-catenin、TGF-akt、JNK和p53，尤其在Wnt/β-catenin信号通路中的作用最为突出［40］。在经典Wnt信号通路中，Axin可与复合体中的其他成员（APC，CK1和GSK-3）以及β-catenin直接结合，因此是降解复合体的中心支架，同时也是降解复合体的限速因子［23］。Axin的磷酸化会改变其构象，从而增强与降解复合物中其他组分的结合，并且可通过去磷酸化来逆转。Wnt信号通路关闭时，Axin被磷酸化，这些磷酸激酶包括 GSK-3、CK 1、Cyclin A/CDK2和 CDK5。Wnt刺激后，Axin去磷酸化，磷酸酶包括PP2A、PP2C和PP1［40-41］。在正常细胞中，Axin在细胞质和细胞核之间不断穿梭，这有助于β-catenin的细胞质定位［42］。

1.2.3.2 APC APC是一种肿瘤抑制因子，Wnt信号转导异常激活导致的结直肠癌大部分是由APC的失活引起的。在Wnt信号转导的经典模型中，APC主要是在降解复合体中起作用，靶向转录共激活因子β-catenin 磷酸化并使其降解［41］。

和Axin一样，APC在细胞质和细胞核间穿梭。APC的N端和中心区域包含功能性核输出信号和核定位信号。APC的中心区域由3个含15个氨基酸和7个含20个氨基酸的重复序列组成，其中含15个氨基酸的序列与β-catenin结合，而含20个氨基酸的序列则介导β-catenin下调［43］。当Wnt信号通路关闭时，APC被GSK-3和CK1磷酸化，磷酸化的APC对β-catenin的亲和力增强，促进β-catenin募集到降解复合体上。APC与β-catenin的结合促进了 GSK-3对 β-catenin的磷酸化［44］。APC 不仅在降解复合物中是必须的，而且在Wnt刺激后促进Axin构象的快速转变以及随后Axin与LRP5/6/Arrow的互作［41］。

1.2.3.3 CK1 CK1是所有真核细胞共有的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶家族［45］。到目前为止，至少有7种哺乳动物CK1亚型（α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε）及其各种剪接体，它们参与细胞膜运输、昼夜节律、细胞周期进程、染色体分离、细胞分化和凋亡等多种细胞过程［46］。所有CK1家族成员具有高度保守的激酶结构域，但在其N末端和C末端非催化结构域存在显著差异。CK1只使用ATP作为磷酸供体，通常不依赖于辅因子［47］。

在Wnt信号通路中，CK1既是负调节因子也是正调节因子。作为负调节因子，CK1在S45位点磷酸化β-catenin，从而启动GSK-3介导的β-catenin磷酸化，CK1也通过磷酸化修饰Axin和APC促进β-catenin的磷酸化降解。CK1通过磷酸化修饰Dvl和TCF3充当Wnt信号通路的正调节剂［46］。除了Wnt信号通路外，CK1还被认为在JNK和刺猬（Hh）信号通路中起到重要作用［47］。对于底物的调节，CK1更倾向于预先对其磷酸化促进其活化。此外，CK1还可通过自磷酸化修饰来调节自身活性［48］。

1.2.3.4 GSK-3 GSK-3是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，最初被发现可将糖原合成酶磷酸化而被鉴定为参与糖原代谢的激酶［49］。近年来，GSK-3被发现参与调节多种信号通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路、Wnt信号通路、Hh信号通路和Notch信号通路，并参与从糖原代谢到细胞周期调节以及细胞增殖等一系列细胞过程［50-51］。

GSK-3由两个基因编码两种不同的亚型：GSK-3α和GSK-3β。它们的催化结构域几乎相同，但它们的C端序列不同，并且GSK-3α包含一个富含甘氨酸的N端区域，而在GSK-3β中却不存在。与其他蛋白激酶相比，GSK-3的一个特点是其底物通常需要被另一个激酶预磷酸化活化［52］。在细胞中，一小部分（＜5%-10%）的GSK-3参与组成降解复合物［50］。当Wnt信号通路处于非激活状态时，CK1先将β-catenin的Ser45位点磷酸化，随后GSK-3依次磷酸化β-catenin的Thr 41、Ser37和Ser 33位点，之后通过蛋白酶体介导的降解使β-catenin在细胞质中维持较低水平［53］。Wnt信号通路激活时，复合体中的GSK-3和CK1将LRP5/6磷酸化，随后Axin被募集到磷酸化的LRP5/6上［54-55］。

2 非经典Wnt信号通路

不同于经典Wnt信号通路，非经典Wnt信号通路并不依赖β-catenin激活下游分子，而通过Dvl将信号传递给其他分子。它在调节细胞极性和迁移方面具有显著的作用。并且一般认为，与经典Wnt信号通路通过Wnt1类型（Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a和 Wnt8b）起 始 信号不同，非经典Wnt信号通路的配体为Wnt5a类型（Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt9b、Wnt11 和 Wnt16）［30，56-58］。 其 中 一 些 Wnt分子 会参与两种Wnt信号通路，诱导不同的细胞反应，如Wnt5a［59］。非经典Wnt信号通路一般包括Wnt/PCP信号通路和Wnt/Ca2+信号通路。

Wnt/PCP信号通路首先在黑腹果蝇中被发现，控制着翅膀上毛发和眼睛内小平面的方向［60］。在脊椎动物中Wnt/PCP又称Wnt/Jun信号通路，控制组织极性与细胞运动，并与胚胎发生和癌变有关。Wnt/PCP信号通路通过激活RhoA、c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和Nemo样激酶（Nemo-like kinase，NLK）信号通路将信号传导至下游。与脊椎动物中激活Wnt/PCP信号通路需要Wnt不同的是，果蝇Wnt/PCP信号通路的激活并不需要Wnt的同源基因wg［61］。激活的Frizzled家族受体和辅受体ROR2、RYK将信号传递至胞内，随后激活Dvl。Dvl可以通过两种小GTP酶RhoA和Rac传递信号，其中RhoA是细胞骨架结构的关键调控因子。从Dvl到RhoA的信号传导需要Formin同源蛋白Daam，Daam结合Dvl和RhoA，介导Dvl-RhoA复合物的形成。RhoA继而激活Rho相关蛋白激酶，影响细胞骨架的形成和细胞运动。另外，Dvl还可激活另一种小GTP酶Rac，随后通过Rac -PAK-MAP3KMAPKK4/7信号级联磷酸化激活JNK信号通路，最终影响靶基因转录［56，62-63］。除了依赖Dvl的RhoA和JNK信号通路外，NLK信号级联可通过不依赖Dvl的方式被Wnt/PCP信号通路激活。与Frizzled偶联的G蛋白介导Ca2+释放，之后激活TAK1，继而激活NLK信号级联。由于激活的NLK负调节经典Wnt信号通路，因此Wnt/PCP信号通路的激活导致经典Wnt信号通路被部分抑制。此外，PCP信号通路还包括许多其他成分，如Vangl、Celsr、PTK7等，这些分子在脊椎动物中的具体作用尚未确定。在 果 蝇 中，Frizzled、Vang、Stan、Dvl、Prickle和Diego是Wnt/PCP的核心分子，它们组成了Frizzled-Dvl-Diego-Stan和Vang-Prickle两种复合体。这两种复合体在翅膀或眼睛中的不对称分布导致了组织极性的建立。另外，Diego和Prickle竞争性结合Dvl，Diego通过与Dvl结合正向调节Wnt/PCP信号通路，而Prickle通过阻止Diego与Dvl的结合负向调节Wnt/PCP 信号通路［64］。

Ca2+作为一种普遍存在的第二信使，调控着广泛的细胞生物学过程，包括肌肉收缩、神经传导、细胞生长或增殖和酶活性调节等［65］。Wnt/Ca2+信号通路以G蛋白依赖的方式刺激细胞内Ca2+的释放并激活一些激酶，以调节细胞运动和细胞黏着性，但G蛋白在信号通路中的作用尚不清楚［66］。Wnt/Ca2+信号通路主要由Wnt5a和Wnt11激活，并且Frizzled-2比Frizzled-1更能诱导Ca2+的释放。首先，Wnt5a/Wnt11与细胞膜上的Frizzled结合后导致Dvl活化，之后激活磷脂酶C（phospholipase，PLC），PLC水解质膜上的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸导致三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）的浓度增加。IP3通过胞质溶胶扩散，与内质网上的钙通道互作，促进Ca2+的释放。此外，5HTIC也以G蛋白依赖的方式刺激细胞内Ca2+的释放［67］。Ca2+和钙调蛋白一起激活两种钙敏感激酶——钙调蛋白激酶II（Ca2+-calmodulindependent protein kinase II，CaMKII）和蛋白磷酸酶calcinurin（Cn）。其中，CaMKII已被认为在许多生物过程中发挥作用，如哺乳动物卵母细胞成熟，神经递质合成和释放。CaMKII被激活后自磷酸化，之后显示出Ca2+独立的自主活性［59］。激活的CaMKII和Cn之后又激活核转录因子NF-κB和NFAT。另外，当质膜上DAG浓度升高，细胞质中的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）被结合到质膜上，然后在Ca2+的作用下被激活，激活的PKC继而激活NF-κB和CREB。Ca2+内流和PKC激活又进一步反馈调节Dvl的磷酸化，使Wnt/Ca2+信号通路被持续激活［68］。之后，NFAT、NF-κB和CREB转移到细胞核并调控下游基因的转录。值得注意的是，NFAT、NF-κB和CREB均被发现在免疫调节中起关键作用［69-71］。此外，Wnt/Ca2+信号通路可能还以钙依赖的方式激活磷酸二酯酶6，导致环鸟苷单磷酸的降低［72］。

也有研究发现，Wnt9b可与受体PKD1/TRPP2复合体的胞外域结合激活Wnt/Ca2+信号通路，之后PKD1与Dvl相互作用将信号传递至下游，而TRPP2可介导Ca2+内流而不依赖于Frizzled和LRP5/6［58］。这种差异可能是由Wnt分子不同而造成的。虽然一般认为LRP5/6不参与非经典信号通路，但也有报道LRP5/6可能参与非经典Wnt信号通路，并可能以复杂的方式抑制或协同作用［73-74］。

除了上述两种非经典Wnt信号通路外，还有Wnt-RAP1、Wnt-ROR2、Wnt-PKA、Wnt-GSK3MT、Wnt-aPKC、Wnt-RYK和Wnt-mTOR 等非经典Wnt信号通路类型。不同Wnt信号通路之间由于共用一些受体和胞内信号传导蛋白而可能互相交叉或重叠，且能通过对Dvl的竞争而互相拮抗［75］。

3 Wnt信号通路在无脊椎动物天然免疫中的功能

近年来，病原与宿主的相互作用，特别是宿主对外来入侵物的免疫应答受到了越来越多的关注［76］。不同于脊椎动物，无脊椎动物缺乏适应性免疫系统，仅依靠天然免疫系统抵御病原体的侵染。因此，天然免疫也成为了脊椎动物和无脊椎动物所共有的第一道防线，有时也是最重要的一道屏障，它包含复杂的信号通路网络来调控免疫应答。

对于无脊椎动物参与天然免疫的信号通路，以Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路、免疫缺陷（immune deficiency，IMD）信号通路和Janus激酶/信号转导与转录激活子（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信号通路研究较多，而Wnt信号通路鲜有报道。然而，在脊椎动物中已有大量研究表明Wnt信号通路在宿主和病原体的博弈中发挥了关键作用。其中，Wnt信号通路不仅有助于增强宿主对病原体侵染的抵抗力，并且由于病原体与宿主的协同进化，病原体也已经进化出了胁迫Wnt信号通路的相关策略，以促进感染和提高在宿主中的生存能力［77-78］。

3.1 病毒免疫

目前，Wnt信号通路在脊椎动物病毒免疫中的研究已经较为深入。现有研究表明，在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type3，BPI-V3）、人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）等多种病毒感染中，Wnt信号通路都扮演了重要角色。而在无脊椎动物中，Wnt信号通路参与的抗病毒天然免疫研究主要集中在对抗白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）中［4，79-80］。

WSSV是一种主要的虾类病原体，在世界范围内造成巨大的经济损失［81］。目前，Wnt信号通路参与WSSV天然免疫的研究主要集中在凡纳滨对虾中。Zhang等［3］发现WSSV侵染凡纳滨对虾后，参与免疫防御的对虾组织（血细胞、肝胰腺、鳃）中的LvWnt表达均受到不同水平调控，说明Wnt基因在凡纳滨对虾的天然免疫中发挥了重要的调控作用。最近有学者发现日本沼虾（Macrobrachium nipponense）受到WSSV侵染，Wnt基因表达谱也发生了显著变化，这可能涉及到它的免疫防御［78］。除了Wnt之外，β-catenin也被证实参与凡纳滨对虾WSSV的免疫。有研究发现WSSV刺激凡纳滨对虾导致其体内Lv-β-catenin的表达先上调后略下调，敲除Lv-β-catenin增强了其对WSSV侵染的敏感性，表明β-catenin作为Wnt信号通路的关键调节因子在凡纳滨对虾抗病毒免疫中起到了积极作用［82］。随后的研究又发现，宿主本身可通过调控促进Lv-βcatenin进入细胞核发挥抗病毒免疫功能。一旦利用GSK-3抑制剂IX激活Lv-β-catenin，则可显著抑制病毒极早期基因WSSV069的转录。此外，研究还发现WSSV可以通过增加Lv-β-catenin的泛素化来影响Lv-β-catenin的表达水平，并通过其所编码的极早期蛋白IE1与Lv-β-catenin相互作用，抑制其进入细胞核，从而限制其抗病毒免疫调控功能［83］。Chibby是Wnt/β-catenin信号通路的重要抑制剂分子，它能与TCF/LEF竞争结合β-catenin并抑制β-catenin的活性。Ruan等［84］采用实时荧光定量PCR检测发现，WSSV可下调凡纳滨对虾体内Lv-Chibby基因的转录水平。进一步的研究证实Lv-Chibby能够与Lv-β-catenin相互作用，并且Lv-Chibby增强了Lv-βcatenin与WSSV069之间的相互作用。此外，Ruan等［85］也发现在WSSV侵染后，调控Lv-β-catenin降解的上游分子Lv-GSK3β的转录和表达水平受到抑制，并且磷酸化水平下调。当Lv-GSK3β沉默时，WSSV基因ie1的转录受到抑制，WSSV诱导的血细胞凋亡也显著上调，说明凡纳滨对虾通过抑制Lv-GSK3β的表达，促进细胞凋亡，进而抑制WSSV感染。综合以上研究表明，Lv-β-catenin是凡纳滨对虾抗病毒免疫的重要调控分子。此外，有报道称β-catenin也参与日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）对WSSV 的免疫应答［86］。

近年来，克氏原螯虾（Procambarus clarkii）作为一种无脊椎动物的模式生物，其天然抗病毒免疫涉及Wnt信号通路已被证实。Du等［87-88］根据克氏原螯虾转录组测序结果，通过对实验组（WSSV侵染）与对照组的差异表达基因进行KEGG通路分析，筛选出一些与天然免疫相关的经典信号通路，如Wnt信号通路、JAK-STAT信号通路、胰岛素信号通路等。之后，Yi等［89］使用RNA-seq对克氏原螯虾WSSV感染的易感个体、病毒抗性个体进行比较转录组分析，发现易感个体中下调、抗性个体中上调的基因在Wnt信号通路中明显富集，即克氏原螯虾Wnt信号通路参与WSSV侵染后的免疫应答。

除甲壳类动物外，WSSV也能被果蝇的S2细胞系识别并吞噬。研究发现，活的WSSV能被果蝇S2细胞吞噬而不能被消化，说明WSSV本身能够破坏宿主细胞免疫系统，阻止其吞噬体的成熟。然而肽聚糖和脂多糖可激活S2细胞表面的受体，促进吞噬体成熟，从而使WSSV病毒粒子被完全成熟的吞噬体吸收和消化。dally作为一种细胞表面蛋白多糖，可调节Wnt信号通路［90］。基因表达谱显示，dally介导Wnt信号通路参与了S2的吞噬作用。dally的沉默显著抑制了果蝇S2细胞系中吞噬体的成熟，表明dally介导的Wnt信号通路可能是吞噬作用的关键［91］。

值得一提的是，在对家蚕（Bombyx mori）核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedro virus，BmNPV）的研究中也发现Wnt信号通路参与了抗病毒免疫过程。Zhang等［92］使用全基因组和转录组分析，检测在有或没有BmNPV感染的家蚕细胞中长链非编码RNA（IncRNA），microRNA（miRNA）和mRNA的表达情况，在差异表达的RNA之间构建了IncRNA-miRNA-mRNA的调控网络，并采用KEGG分析来预测差异表达miRNA的靶基因，结果显示差异表达的IncRNA参与调节49条信号通路，其中前20位信号通路中包括Wnt信号通路。

另外，非经典Wnt信号通路也被证实参与无脊椎动物的先天免疫调节。Wnt5b作为非经典Wnt信号通路的配体，启动非经典Wnt信号通路。Wang等［93］发现凡纳滨对虾感染WSSV后，LvWnt5b转录水平下调，敲低LvWnt5b可抑制WSSV基因ie1的转录水平，提示LvWnt5b介导的Wnt信号通路可能在WSSV感染的防御中发挥作用。在HEK293T细胞中过表达LvWnt5b可抑制caspase3/7的活性，进一步证明了LvWnt5b在抑制细胞凋亡中的作用。该研究表明，凡纳滨对虾可能通过下调LvWnt5b的表达，促进细胞凋亡来抵御WSSV的侵染。Cdc42作为Rho GTP酶的一个重要成员，参与Wnt非经典信号通路的调控［94］。在日本囊对虾受到WSSV侵染时，MjCdc42的表达显著上调。通过RNA干扰和注射Cdc42抑制剂抑制MjCdc42的表达可使WSSV的复制增加。由此证明MjCdc42具有抑制WSSV增殖的功能。进一步实验发现MjCdc42通过抑制精氨酸激酶（MjAK）来抑制宿主体内病毒的复制和扩增［95］。

3.2 细菌免疫

Wnt信号通路最近已被证明可以控制与人类细菌感染相关的过程，并发现了一些激活或抑制Wnt信号通路的药物来调节Wnt信号通路，以此增强宿主免疫［96］。在无脊椎动物中，无论在抗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌中，Wnt信号通路都在其中起到关键作用。

3.2.1 革兰氏阴性菌免疫 副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）是一种常见的革兰氏阴性菌，是多种水生生物的主要病原菌。Wnt受体Frizzled、Wnt转运蛋白Wntless均被报道在副溶血弧菌侵染罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）中参与天然免疫应答［97-98］。另外，Zhang等［82］通过副溶血弧菌侵染凡纳滨对虾发现，Lv-β-catenin在抗副溶血弧菌侵染中起积极作用，并且首次证实了对虾中β-catenin可调节抗菌肽（AMP）的转录。此外，2020年，Jin等［99］用副溶血弧菌感染拟穴青蟹（Scylla paramamosain），在感染后进行了小RNA测序，并比较了无弧菌和受弧菌感染的青蟹中miRNA的表达谱，以表征差异表达的miRNA。结果显示差异表达的46个miRNA中，其中5个miRNA靶向Wnt信号通路。

嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）为典型的人、兽、鱼共患病原菌。受嗜水气单孢菌感染的罗氏沼虾，体内Wntless升高，敲低Wntless导致虾累积死亡率显著升高。以上结果说明Wntless参与虾抗嗜水气单孢菌的免疫调控［98］。Xie等［86］发现，感染鳗弧菌（Vibrio anguillarum）的日本囊对虾组织中β-catenin的转录水平上升，这是首次发现虾体内的β-catenin参与了鳗弧菌的免疫应答。王菲等［100］对家蚕免疫稳态调控分子进行了首次报道，家蚕被大肠杆菌（Escherichia coli）感染后，免疫组织如脂肪体、体壁和中肠中BmWnt1基因的转录水平与未感染的家蚕相比均显著下调，提示家蚕中的Wnt1基因可能与其天然免疫调控密切相关。

除了上述经典Wnt信号通路外，非经典Wnt信号通路也被证实参与无脊椎动物抗菌天然免疫。Wnt4和Wnt16都属于非经典Wnt信号通路的配体。最近一项研究发现，日本沼虾受副溶血弧菌侵染后，胃中Wnt的转录水平升高，并且减少Wnt4和Wnt16的表达可显著抑制副溶血弧菌侵染后虾胃中抗菌肽的表达。这表明Wnt基因家族可能通过调节抗菌肽的合成，参与机体对弧菌感染的天然免疫应答［78］。RhoA作为非经典Wnt/PCP信号通路的重要成员，也被证实参与天然免疫。研究显示，当日本囊对虾感染鳗弧菌时，MjRhoA在血细胞与心脏中的表达水平显著上调。利用RNA干扰抑制MjRhoA的表达水平后，对虾清除细菌的能力与对虾的存活率均明显降低。这些结果证实MjRhoA在体内具有调控抵抗细菌感染的能力［95］。

3.2.2 革兰氏阳性菌免疫 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革兰氏阳性菌的代表，广泛分布于自然界。有研究称，感染金黄色葡萄球菌的日本囊对虾体内β-catenin异常上调，之后通过RNA沉默实验证实β-catenin是虾抗菌免疫所必须的［50］。Kim等［101］研究发现，在秀丽隐杆线虫中，β-catenin同源基因BAR-1的缺失导致了不完全的免疫反应和对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、金黄色葡萄球菌的异常易感性。益生菌嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）NCFM菌株可显著增强秀丽隐杆线虫对革兰氏阳性病原体的宿主防御反应，这种调节作用通过激活宿主相关免疫信号通路实现，这些信号通路包括 Wnt、TIR-1、PMK-1［101］。此外，在日本沼虾中也发现Wnt基因可能参与抗金黄色葡萄球菌的免疫应答［78］。

王菲等［100］在被黑胸败血芽孢杆菌（Bacillus bombyseptieus）感染后的家蚕幼虫血细胞和头部中检测到BmWnt1基因的高水平表达，但此高水平的表达量迅速下降，并不能持续。与此形成对比的是，在其他免疫组织中所检测到的BmWnt1的转录水平均为非感染时的50%以下。该研究表明家蚕Wnt家族成员参与了免疫稳态调控，并且Wnt可能通过调控抗菌肽等效应分子的产生参与免疫应答。

3.3 其他病原体免疫

除了病毒和细菌外，Wnt信号通路还参与了其他病原体的天然免疫，如真菌、线虫和螺原体等。

受白僵菌（Beauveria bassiana）感染的家蚕，其脂肪体、体壁和中肠中的BmWnt1转录水显著下降，表明Wnt1可能涉及家蚕的天然免疫应答［100］。Arefin 等［102］用异小杆线虫（Heterorhabditis bacteriophora）及其共生菌发光杆菌（Photorhabdus luminescens）感染果蝇后对果蝇进行全基因组转录测序，并将所有差异调节的转录本映射到KEGG数据库，发现Wnt信号通路、泛素介导的蛋白水解、卵母细胞成熟信号通路的富集最为显著，其中泛素介导的蛋白水解也与Wnt信号通路相关。

中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasma eriocheiris）是引起中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）震颤病的一种致死性病原体。Wang等［103］向中华绒螯蟹体内注射中华绒螯蟹螺原体，同时用只注射等量PBS的中华绒螯蟹作为对照组。获得cDNA后使用Illumina HiSeq 2500测序平台对两组的血细胞进行转录组分析，并通过KEGG通路分析鉴定了一些经典的免疫相关信号通路，包括Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路等。之后Hou等［65］也证实Wnt信号通路参与中华绒螯蟹的螺原体免疫。首先，使用Illumina HiSeq 2500获得了实验组和对照组的胸神经节转录图谱，之后通过RPKM分析筛选出差异表达的基因。与对照组相比，实验组Wnt信号通路、Ca2+调节相关过程等基因的转录水平发生了显著变化。一方面，实验组3种Frizzled的转录水平均发生了显著下调，提示中华绒螯蟹螺原体的入侵可能通过抑制Wnt信号通路，降低宿主免疫应答，促进自身感染。另一方面，与Ca2+调节相关基因如IP3R、ERp44、Syt均显著下调，而Ca2+调节与非经典Wnt/Ca2+信号通路密切相关，提示螺原体通过干扰Ca2+调节，抑制Wnt/Ca2+信号通路，影响神经递质的释放，从而导致神经信号紊乱［65］。因而确定经典Wnt信号通路和非经典Wnt/ Ca2+信号通路为中华绒螯蟹胸神经节应答中华绒螯蟹螺原体感染的关键途径。

4 Wnt信号通路与其他信号通路的交联及潜在功能

生物体中，各信号通路之间密切交织。这种由多条信号通路形成的网络有利于不同分子、不同细胞之间的通讯，从而可以迅速有效地对外界变化做出快速响应。在无脊椎动物中，已有相关研究表明信号通路之间可通过相互交联调控机体的免疫功能。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，Toll和IMD信号通路可协同诱导AMP的表达，激活先天免疫应答［104］。Toll、IMD和JAK/STAT是无脊椎动物参与天然免疫的3条主要信号通路，它们在进化中具有广泛的保守性，且它们都与Wnt信号通路存在密切关联，这可能提示Wnt信号通路参与更多的天然免疫调控。

Toll信号通路主要由革兰氏阳性菌或真菌激活，其在无脊椎动物天然免疫中的功能已被大量报道［105］。Toll及其同源物TLR是病原体识别过程中重要的模式识别受体（PRR），由它们介导的Toll信号通路可使NF-κB活化后进入细胞核与κB结合，调控抗菌肽、干扰素等免疫相关基因的表达［106-108］。果蝇Toll信号通路能有效抑制果蝇X病毒（DXV）的复制，控制念珠菌（Candida glabrata）等真菌感染［109-110］。皱纹鲍鱼（Haliotis discus）的 TLR 在副溶血弧菌、李斯特菌（Listeria monocytogenes）和出血性败血症病毒（hemorrhagic septicemia virus）感染后表达量上调［111］。此外，在梭子蟹（Portunus trituberculatus）、厚壳贻贝（Mytilus coruscus）、水螅（Hydra）等无脊椎动物中都有报道显示Toll信号通路参与天然免疫［112-114］。已有一些研究证明了Wnt信号通路与Toll信号通路之间存在交联。有研究表明，介导Toll信号通路的NF-κB转录因子p65在受刺激的巨噬细胞中促进Wnt5a的表达［115］。巨噬细胞的天然免疫功能至少部分是通过Wnt5a-Frizzled5-NF-κB（p65）信号级联来实现的，p65又反馈维持Wnt5a的表达。该信号级联不仅维持基础水平的免疫防御，还调节免疫相关蛋白CD14的表达，CD14与TLR2共同作用，有助于识别和控制李斯特菌的感染［116］。而且p65作为IRF3的转录共激活剂可诱导IFN的合成［1］。此外，Wnt1通过与Scavenger受体A结合，增加NF-κB蛋白水平，促进IL-6，TNF-α 和 iNOS的分泌［117］。Wnt3a和 Wnt5a分别是经典和非经典Wnt信号通路的配体。在鼠巨噬细胞内发现，Wnt3a和Wnt5a均有能力诱导炎症细胞因子的产生，其对炎症反应的影响呈TLR4依赖性。但Wnt3a和Wnt5a抑制TLR2和TLR9刺激下的细胞因子的产生。有趣的是，使用Wnt信号通路抑制剂并不能抑制Wnt3a和Wnt5a诱导的巨噬细胞因子的产生，这说明Wnt3a和Wnt5a诱导的巨噬细胞炎症反应可能不是典型Wnt与Wnt受体相互作用的结果［118］。WntD为果蝇Wnt家族的一员，在调节抗菌基因转录中有积极作用。但WntD不是经典Wnt信号通路的配体，其可能通过非经典Wnt信号通路发挥作用。Gordon等［119］证明了WntD的表达是由Toll信号通路诱导的。通过基因敲除发现，WntD功能缺失突变体具有免疫缺陷并且Toll/Dorsal信号升高，说明WntD负反馈调节Toll信号通路。激活Toll信号通路可使果蝇更容易受到病毒感染，因此我们推测，WntD可能通过抑制Toll信号通路，在果蝇抗病毒免疫中发挥积极作用。

IMD信号通路主要被革兰氏阴性菌激活，它是除Toll信号通路外另一条介导NF-κB的信号通路。IMD 与 Toll信号通路在功能上互补［108］。Yokoi等［120］发现，赤拟谷盗（Tribolium castaneum）中IMD信号通路有助于防御阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。又有研究发现，大肠杆菌DH5α注射侵染后会迅速激活橘小实蝇IMD信号通路的免疫反应［121］。另外，还有许多研究均证实IMD信号通路在不同无脊椎动物天然免疫中的重要功能。Wnt/PCP信号通路中的TAK1可以激活IMD信号通路关键组分Relish，这为Wnt和IMD信号通路的交联提供了直接证据。此外，已有不少证据表明Wnt与NF-κB存在密切联系。β-catenin除了调节Wnt信号通路外，还参与NF-κB靶基因的调控，如IL-6和Wnt16［122］。由非经典Wnt信号通路成员Rac1激活NF-κB可驱动肠道干细胞增殖和结直肠癌的发生［123］。并且IMD和与Wnt信号通路密切交织的Toll信号通路之间的串联已被报道。Nishide等［124］通过RNAi实验揭示了IMD和Toll信号通路之间显著的功能交联。IMD信号通路和Toll信号通路的RNAi均抑制了这两条信号通路效应分子的上调。另一方面，Wnt信号通路与JNK信号通路之间存在信号级联。在非经典Wnt/PCP信号通路中，Wnt可通过激活小GTP酶Rac将信号传导至JNK信号通路。而JNK信号通路介导IMD通路。有研究发现JNK可以通过PDGFP和Pvr反馈抑制IMD信号通路。并且IMD信号通路的激活促进了Pvr配体Pvf2和Pvf3的JNK依赖性表达，进而通过Pvr-ERK减弱IMD信号通路［125］。此外，由此判断Wnt信号通路与IMD信号通路的密切关联，也因此推断Wnt信号通路在天然免疫中有很大的潜能。

JAK/STAT是另一条涉及天然免疫的重要信号通路。研究表明，在波纹巴非蛤（Paphia undulate）中，JAK/STAT信号通路在细菌清除方面起着至关重要的作用［126］。另外，JAK/STAT信号通路还参与果蝇虹彩病毒6（Iridescent virus 6）、寄生蜂（Leptopilina boulardi）等多种病原体天然免疫［127-128］。STAT3是JAK/STAT信号通路的关键分子。先前的研究表明，Wnt信号可以刺激早期斑马鱼发育过程中STAT3的活性。之后，STAT3被证明是Wnt信号通路通过TCF4和LEF1的直接转录靶点，并且STAT3与LEF1存在直接相互作用。此外，在APC突变体中STAT3的表达和磷酸化水平增加［129］。在原代棕色前脂肪细胞中，STAT3在分化诱导期是必须的，STAT3的缺失会导致Wnt1、Wnt3a和Wnt10b的表达增加，STAT3的缺失可以通过抑制经典Wnt信号通路或敲除β-catenin来挽救。另有研究表明，Wnt3a可促进STAT3的核定位，Wnt1和Wnt3a可以提高胚胎干细胞中STAT3的基因表达和蛋白水平［130］。这两条信号通路的交联在癌症中也有报道。AKT/β-catenin驱动的肝癌细胞中富含活化的STAT3，用JAK/STAT信号通路的小分子抑制剂处理肝癌细胞，可以使活性β-catenin减少，并且能够有效地减轻 AKT/β-catenin 驱动的肝癌细胞形成和增殖［131］。以上研究均有力证明了JAK/STAT与Wnt信号通路之间的互作，这有助于更深入地了解Wnt信号通路的免疫调控功能。

除了上述信号通路，Wnt信号通路还与PI3K/AKT、MAPK/PKC、Hippo等多条信号通路存在交联，共同组成免疫信号调控网络［61，132-136］。

5 结语

Wnt信号通路在多种天然免疫相关过程中发挥重要作用，其正常的功能和调控对宿主至关重要。目前国内外对无脊椎动物Wnt信号通路涉及天然免疫的研究甚少，并且主要通过基因筛选的方法证明Wnt信号通路在天然免疫中的作用。即使有部分Wnt信号通路中的基因在体内得到了功能验证，但其具体的功能机制仍不清楚，需要更深入的研究。Wnt信号通路与其他信号通路的串联和合作有利于进行有效的免疫应答。现有研究发现Wnt与其他免疫相关信号通路如Toll、IMD、JAK/STAT等均有交联。这些信号通路在无脊椎动物天然免疫中的研究较为广泛和成熟，这有利于更好地发掘Wnt信号通路在无脊椎动物天然免疫中的功能。