阿魏酸钠对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

王 畅，陈 炜

1成都中医药大学；2西南交通大学，成都 610000

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是皮肤深度烧伤、严重创伤后致局部组织的异常修复，是创伤最常见的并发症[1]。HS发病机制十分复杂，治疗方面尚无突破性进展[2]。中医药在防治瘢痕方面历史久远，治疗以活血化瘀、软坚散结为主，研究发现中药川芎、当归治疗HS疗效较好[3-5]。

阿魏酸钠(sodium ferulate，SF)是阿魏酸(ferulic acid，FA)的钠盐，易从传统活血化瘀类中药——川芎、当归中提取，具有抗炎镇痛、调节免疫、抗纤维化等作用，不良反应少、安全性高，是我国完全自主研发的药物，临床上主要用于动脉粥样硬化、冠心病、脑血管病等心脑血管疾病[6]。瘢痕组织是肉芽组织经改建成熟形成的成纤维结缔组织[7]，近年发现SF对肝、肾、肺组织具有抗纤维化的作用[8,9]，由于HS的病理生理机制与纤维化存在相似性，因此两者的研究往往可以相互借鉴[10]。课题组前期实验也发现，将含有SF的复合物外涂于兔耳，能有效抑制家兔瘢痕增生[11]。在此基础上，本研究采用体外实验，探讨SF对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原表达的影响，为SF用于HS提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

阿魏酸钠(批号：160201，成都亨达药业有限公司)；胎牛血清(批号：20150514，杭州四季青生物制品研究所)；0.25%胰蛋白酶(批号：J150031)、高糖DMEM培养液(批号：AAK208933，Hyclone公司)；四甲基偶氨咗盐(批号：298-93-1，美国Amresco公司)；二甲基亚砜(批号：D-5879，Biosharp公司)；Ⅰ型胶原单克隆抗体(批号：SC59772，美国SANTA公司)；Ⅲ型胶原多克隆抗体(批号：SC8780-R，美国SANTA公司)。

1.2 实验细胞

人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)购于上海素尔生物科技有限公司，系3～4代传代细胞。

1.3 主要仪器

1.4 方法

1.4.1 细胞培养、鉴定

将复苏细胞按规定进行消化传代，HE、免疫组化细胞[12]鉴定本实验所用细胞为HSFb。

1.4.2 SF的LC50、实验分组及最佳有效时间测定

MTT法测定SF在1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL浓度下的细胞抑制率，设计量效关系曲线并计算SF的LC50。测定SF在不同时间对细胞增殖抑制的影响，确定SF的高、中、低浓度及最佳有效时间。

1.4.3 形态学观察

以2.14×105/mL细胞密度接种于24孔板，加入高、中、低浓度的SF经72 h后置于倒置显微镜下、电镜下行细胞形态学观察。

1.4.4 MTT法测定不同浓度的SF对细胞增殖的影响

妊娠和分娩对女性机体是一个较大的应急事件，妊娠时的饮食、运动量、血压及体质管理都关系到母婴的结局，产后生殖器官(乳房外)需恢复到非孕状态，产妇身体虚弱，抵抗力差，同时又面临着哺乳、育儿，形体的恢复等一系列的问题，这个时期健康教育指导对孕产妇是至关重要的[4]。本研究对围产期孕产妇实施全程个体化系统管理模式，即从孕前、孕早期、妊娠期、分娩期直至产褥期包括新生儿的护理，实施个体化的系统管理。

细胞接种于96孔板，置入37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后，吸去孔内培养上清液。加入不同浓度SF，空白对照组加入等量的DMEM培养液后，置入培养箱中继续培养72 h，再在每孔添加180 μL不含血清的培养液和20 μL/孔的MTT，震荡10 min。自动酶标仪上测定每孔在490 nm处的光密度，即OD值。每组设5个复孔，实验重复3遍。

1.4.5 Western blot法检测SF对HSFb的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

细胞接种于24孔板，每组设4个复孔，加入不同浓度的SF(空白对照组加入等量的DMEM培养液)72 h后,离心并收集细胞。加入细胞裂解液80 μL，离心收集上清液即总蛋白。测定蛋白浓度，制作浓缩胶及分离胶，水封静置30 min，凝胶电泳2 h后，转膜30～50 min，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，分别加入1∶200稀释的一抗在印迹膜室温孵育2 h、洗膜后，加入二抗室温孵育2 h，洗膜发光，凝胶成像系统中曝光成像并统计分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 细胞鉴定

HE染色后，在光镜下可见细胞呈长梭形或三角形，细胞核着蓝色，细胞浆嗜酸性着色，胞浆两级突起、长短不一，部分核仁为双核仁，细胞数量较多，提示分裂旺盛(图1A)。波形蛋白免疫组化染色后，在镜下可见细胞质呈棕褐色，细胞核呈蓝紫色(图1B)，为阳性表达。

图1 细胞鉴定Fig.1 Cell identification注：A：细胞(HE×200)；B：细胞(IHC×400)Note:A:Cell (HE×200);B:Cell (IHC×400).

2.2 SF的LC50 及实验分组及最佳有效时间测定

MTT法测定SF在1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL浓度下的细胞抑制率(表1)，在SPSS行“线性回归分析”计算SF的LC50=0.307 5 mg/mL，绘制量效关系曲线(图2)。SF在1～0.001 mg/mL浓度对细胞抑制明显，结合药物LC50和参考文献中SF[13,14]对细胞有效浓度的设定，设定本实验的SF高、中、低浓度组分别为：0.3、0.03、0.003 mg/mL。

MTT法测定不同浓度SF在0～72 h对HSFb的细胞增殖的影响(表2，图3)，结果显示SF在0～72 h对细胞抑制呈上升趋势并在72 h抑制率最强。本实验将72 h设定为SF最佳有效时间。

表1 SF对HSFb 增殖的影响

表2 SF在不同时间对HSFb增殖的影响

图2 SF量效关系曲线Fig.2 Dose-effect curve of SF

图3 SF对HSFb细胞增殖的影响Fig.3 Effect of SF on HSFb cell proliferation

2.3 SF对HSFb细胞形态的影响

2.3.1 倒置显微镜观察

对照组的细胞形态规则，平行排列，多呈长梭形，走向基本趋于一致。SF各组细胞变短、细胞梭状突起回缩，形态逐渐变圆、脱壁，与邻近细胞接触减少，细胞间隙变大，贴壁细胞减少。随着SF浓度的增加，细胞变得更加稀松，棱形更加不明显，SF-H组已见大量细胞脱落漂浮于培养液中(图4)。

图4 倒置显微镜观察SF对HSFB细胞形态的影响(×100)Fig.4 Effect of SF on HSFb cells by inverted microscope (×100)注：A：空白组；B：SF低剂量组；C：SF中剂量组；D：SF高剂量组。Note:A:Control;B:SF-L;C:SF-M;D:SF-H.

2.3.2 透射电镜观察

对照组的细胞核较大，核膜清晰完整，染色质分布较均匀,胞浆中有较丰富的线粒体、粗面内质网和核糖体等细胞器，结构完整清晰。SF组的细胞核固缩，染色质丢失，胞浆中可见线粒体轻度肿胀，粗面内质网出现扩张呈囊泡状，有较多的空泡、自噬(图5)。

图5 SF对HSFB 细胞形态的影响(×20 000，1 μm)Fig.5 Effect of SF on HSFb cells by electron microscope (×20 000,1 μm) 注：A：空白组；B：SF低剂量组；C：SF中剂量组；D：SF高剂量组。细胞核(N)、线粒体(Mi)、粗面内质网(RER)。Note:A:Control;B:SF-L;C:SF-M;D:SF-H.Nuclear nucleus (N),itochondria (Mi),rough endoplasmic reticulum (RER).

2.4 SF对HSFb增殖活力的影响

MTT法检测结果见表3，SF作用于HSFb 72 h后，细胞增殖活力降低且有一定的浓度依赖性。与空白对照组比较，均有显著性统计学差异(**P<0.01)。

表3 SF对HSFb增殖活力的影响

2.5 SF对HSFb的I、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

Western blot结果见表4、图6：与空白对照组相比，低浓度SF组的I型胶原蛋白表达降低，差异有统计学意义(*P<0.05)，中、高浓度SF组的I、Ⅲ型胶原蛋白表达显著性降低，差异具有显著统计学意义(**P<0.01)。

3 讨论

HS是创伤后皮肤结缔组织异常修复愈合的结果[7]，现代医学治疗HS尚无突破性进展[2]。中医药防治瘢痕历史久远[15],活血化瘀类中药川芎、当归有较好疗效。有文献统计，在防治病理性瘢痕中，川芎使用9次，当归使用8次[5]。SF作为传统中药材——川芎、当归的主要活性成分，取材方面、价格低廉、药效稳定，目前已广泛用于治疗心血管、肾脏疾病[16]。近年发现SF还具有抑制肝、肺、肾组织纤维化的作用[8-10]。由于HS的病理生理机制与纤维化存在相似性，因此两者的研究往往可以相互借鉴[10]。课题组前期实验也发现，含有SF的复合物能有效抑制兔耳瘢痕增生[11]。

表4 HSFb的I、Ⅲ型胶原蛋白表达

图6 Western blot 分析SF对HSFb的I、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响Fig.6 Western blot results of collagen I and Ⅲ protein expression of HSFb induced by SF

成纤维细胞过度增殖是HS形成的细胞学基础。SF对HS中的成纤维细胞是否有抑制作用，目前尚未见文献报道。MTT法是目前常用的检测细胞增殖的方法,本实验MTT结果提示，不同浓度的SF均可明显地抑制HSFb增殖(P<0.01)。

成纤维细胞可诱导分泌大量的胶原蛋白[17]，而过量的胶原合成是HS发生的病理基础。在HS中，主要胶原成分是Ⅰ型和Ⅲ型胶原，这些胶原在HS形成过程不断合成并沉积加剧病情。因此，测定I、Ⅲ型胶原含量是衡量瘢痕增生程度的客观指标，也是研究防治HS的一个重要方向。本实验用Western blot法表明，SF可抑制I、Ⅲ型胶原蛋白的表达。

研究发现，成纤维细胞的微观形态正常是分泌、储存大量胶原蛋白的形态学基础[18]。在倒置显微镜下，我们发现，加入SF后的 HSFb形态变得不规则，部分细胞脱落悬浮在培养液中。透射电镜则发现，加入SF后的HSFb微观形态出现异常，如出现核固缩，染色质丢失，线粒体轻度肿胀，粗面内质网出现扩张呈囊泡状，有较多的空泡、自噬等，这些从另一个方面说明，SF可致HSFb分泌胶原蛋白的功能衰退，甚至出现凋亡的趋势。

本实验初步说明SF在体外可抑制HSFb增殖和I、Ⅲ型胶原蛋白表达，其在体内是否仍然具有抗瘢痕增生作用，则需要我们进一步开展体内实验以探讨研究。