黄芩配伍川贝母后黄芩中主要化学成分含量变化及抗肺炎作用研究

崔长升，孙丽平，左明锦，汪 莹，闫凯莉，陈昊媛，齐 滨*，刘 莉*

1长春中医药大学 药学院，长春 130117；2长春中医药大学附属医院，长春 130000

黄芩(Scutellariae Radix，SR)具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效[1]，其主要活性化学成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等[2,3]，具有抗菌消炎、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、保护肝脏、降血脂、抑制中枢神经等作用[4]。川贝母(Fritillariae Cirrhosae Bulbus，FCB)药用历史非常悠久，始载于秦汉时期的《神农本草经》，列为中品，气味辛、平，无毒，主伤寒烦热[5]。黄芩川贝母相互配伍具有清热解毒、止咳平喘的功效。在现代临床应用中，多将二者配伍治疗肺炎[6]、小儿外感发热[7]、肺纤维化[8]等，且效果显著。在抗击新型冠状病毒(coronavirus disease 2019，COVID-19)疫情中，也将二者配伍用来治疗被感染的患者[9]。

本课题采用高效液相色谱法对黄芩配伍川贝母后黄芩中主要化学成分含量变化进行考察，并探索二者配伍前后对LPS诱导肺炎小鼠的治疗作用。以期从化学成分、药效两个角度探究黄芩川贝母配伍应用的合理性及科学内涵，为其临床应用提供实验理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

黄芩苷(批号：DST191012-023)、汉黄芩苷(批号：DST190709-026)、黄芩素(批号：DST190518-024)、汉黄芩素(批号：DST190212-025)，均购自成都乐美天医药科技有限公司；黄芩、川贝母饮片购自长春中医药大学附属医院；醋酸地塞米松(遂成药业股份有限公司)；LPS(上海昂一生物科技有限公司)；HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒(上海优选生物科技有限公司)；甲醛、二甲苯(北京化工厂)。

1.2 实验动物

ICR小鼠雄性，体重18～22 g，SPF级，购自长春市亿斯实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(吉)-2018-0007。

1.3 实验仪器

高效液相色谱仪(岛津 LC-2030)；DV215CD电子天平(OHAUS公司)；CP214电子天平(奥豪斯仪器常州有限公司)；高速冷冻离心机(ST-40R型，赛默飞世尔科技中国有限公司)；酶标仪(Infinite M200 Pro型)；轮转切片机(RM2245型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；自动包埋机(EG1150H型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；烘片机(HI1220型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；铺片机(HI1210型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；三用恒温水浴槽(DK-420S，上海精宏实验设备有限公司)；体视显微镜(尼康SMZ25型，北京瑞科中仪科技有限公司)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱AgiLent ZORBAX EcLipse PLus C18(4.6×250 mm，5 μm)。以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序：0～10 min，22%→25% A；10～15 min，25% A；15～25 min，25%→32% A；25～30 min，32%→40% A；30～35 min，40% A；35～40 min，40%→50% A；40～45 min，50%→95% A；45～50 min，95% A。流速1 mL/min，检测波长276 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

取黄芩、川贝母饮片，粉碎，过80目筛。按黄芩(固定1.5 g)与川贝母不同配比3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、2∶3、1∶3、0∶3分别称量，加100 mL蒸馏水加热回流40 min，以3 000 rpm 离心5 min，沉淀物再次加入100 mL蒸馏水加热回流30 min，以3 000 rpm 离心5 min，合并两次上清液，定容至250 mL，取1 mL，加70%甲醇定容至5 mL，过膜，作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备

取黄芩苷4.11 mg、汉黄芩苷4.10 mg、黄芩素3.00 mg、汉黄芩素3.11 mg分别定容至10 mL，制成浓度为0.411、0.410、0.300、0.311 mg/mL的标准品溶液。

取黄芩苷标准品溶液5 mL、汉黄芩苷标准品溶液2 mL、黄芩素标准品溶液1 mL、汉黄芩素标准品溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度线，制成含黄芩苷为0.205 50 mg/mL、汉黄芩苷为0.082 00 mg/mL、黄芩素为0.030 00 mg/mL、汉黄芩素0.003 11 mg/mL的混合标准品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系的考察

分别精密吸取“2.2.2”项下混合标准品溶液5、4、2.5、1、0.5、0.25 mL至5 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度线。按照“2.1”项下色谱条件，进样体积为20 μL，以峰面积(Y)为纵坐标、浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。

2.3.2 精密度试验

取混合对照品溶液，重复测定6次。

2.3.3 重复性试验

取3∶0比例的黄芩川贝母6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定。

2.3.4 稳定性试验

取供试品溶液，室温下放置，分别于0、3、6、12、18、24 h进样分析。

2.3.5 加样回收率试验

取已知3∶0比例的黄芩川贝母6份，每份0.15 g，分别加入黄芩苷14.102 1 mg、汉黄芩苷3.803 1 mg、黄芩素1.630 6 mg、汉黄芩素0.337 2 mg标准品，按照“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。

2.4 样品的测定

取黄芩、川贝母饮片，粉碎，过80目筛。按黄芩(1.5 g)与川贝母不同配比3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、2∶3、1∶3、0∶3分别称量，按照2.2.1项方法制备供试品溶液。按“2.1”项色谱条件分进样体积为10 μL，记录峰面积，计算黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素含量，平行做三次，取平均值。

2.5 体内抗肺炎活性研究

2.5.1 实验药物制备

取黄芩3 g，加入60 mL蒸馏水，加热回流1 h，以3 000 rpm离心5 min，沉淀物再次加入60 mL蒸馏水加热回流30 min，以3 000 rpm 离心5 min，合并两次上清液，浓缩至24 mL；取川贝母3 g，加入60 mL蒸馏水，加热回流1 h，以3 000 rpm离心5 min，沉淀物再次加入60 mL蒸馏水加热回流30 min，以3 000 rpm离心5 min，合并两次上清液，浓缩至24 mL；取黄芩川贝母各3 g，加入60 mL蒸馏水，加热回流1 h，以3 000 rpm离心5 min，沉淀物再次加入60 mL蒸馏水加热回流30 min，以3 000 rpm 离心5 min，合并两次上清液，浓缩至24 mL。

2.5.2 动物分组与处理

将36只小鼠随机分为6组，分别为空白组(control group)、LPS组(LPS group)、阳性药组(treatment group)、黄芩组(SR group)、川贝母组(FCB group)、黄芩-川贝母组(SRFCB group)，每组6只；阳性药组、黄芩组、川贝母组、黄芩-川贝母组分别给予地塞米松2 mg/kg、黄芩提取液0.1 mL/10 g(相当于黄芩给生药量1.2 mg/10 g)、川贝母提取液0.1 mL/10 g(相当于川贝母给生药量1.2 mg/10 g)、黄芩川贝母混提取液0.1 mL/10 g(相当于给黄芩川贝母生药量各1.2 mg/10 g)，连续给药6天，第7天，实验组腹腔注射LPS 10 mg/kg，空白组注射等体积的生理盐水，LPS造模6 h。

2.5.3 样本采集

摘取眼球，收集全血0.5～1 mL，静置20 min，4 ℃，3 000 rpm离心15 min，取血清至-80 ℃保存；取左肺大叶至10%中性甲醛中固定。

2.5.4 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的测定

采用ELISA法，按试剂盒说明书检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度。

2.5.5 小鼠肺组织病理学观察

取固定好的小鼠肺组织，脱水、透明、石蜡包埋，切片厚度为5 μm，进行苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察各组小鼠肺组织的病理学变化。

2.5.6 统计方法

使用GraphPad Prism 8 软件中One-way ANOVA进行统计分析，均值以mean±SD表示。

3 结果

3.1 方法学考察结果

3.1.1 线性关系

黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的线性回归方程分别为Y=4×107X+2.142 0×104(R2=0.999 9)；Y=4×107X-1.975 8×104(R2=0.999 9)；Y=6×107X-1.807 1×104(R2=0.999 8)；Y=6×107X-1.804 3×103(R2=1)；线性范围分别为20.550～411.000、8.200～164.000、3.000～60.000、0.311～6.220 mg/L。4种成分分别在其线性范围内线性关系良好。

3.1.2 精密度

测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.2%、0.3%、0.1%、0.2%，表明仪器的精密度良好。

3.1.3 重复性

测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量的RSD分别为0.5%、0.6%、1.3%、0.5%，表明方法的重复性良好。

3.1.4 稳定性

测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.2%、0.2%、0.1%、0.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.1.5 加样回收率

由回归方程计算样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均回收率分别为99.94%、102.93%、98.01%、97.68%，RSD分别为1.17%、1.55%、1.32%、1.96%，表明该方法的加样回收效果较好。

3.2 供试品溶液测定结果

混合标准品及不同比例供试品溶液高效液相色谱图如图1所示。根据各标准品的线性方程计算黄芩川贝母配伍后黄芩中四种主要化学成分的含量结果如表2所示。根据结果分析得知，黄芩川贝母的配伍比例在3∶1～2∶3之间，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的溶出率变化小于6%，当黄芩川贝母的配伍比例达到1∶3时，四种化学成分的总量下降了23.7%。

图1 混合标准品(A)及不同比例供试品(B)高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatograms of mixed standards(A) and test solutions of different ratios(B)注：1.黄芩苷；2.汉黄芩苷；3.黄芩素；4.汉黄芩素。S1～S7分别为黄芩∶川贝母=3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、2∶3、1∶3、0∶3。Note:1.Baicalin;2.Wogonoside;3.Baicallein;4.Wogonin.S1-S7 was SR∶FCB=3∶0,3∶1,3∶2,3∶3,2∶3,1∶3,0∶3,respectively.

3.3 抗肺炎活性

3.3.1 一般情况

空白组小鼠表现正常，活泼，反应灵敏；模型组小鼠腹腔注射LPS后，反应逐渐迟钝，饮食减少，被毛竖起，呼吸加快，全身颤抖，肺部有湿罗音，腹泻。各给药组与LPS组小鼠相比，状态稍好。

3.3.2 给药组对小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响

各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量如表2、图2所示。与空白组相比，模型组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α极显著升高，说明造模成功；与阳性药组相比，黄芩组、川贝母组、黄芩-川贝母组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α均有极显著性差异，黄芩-川贝母组与阳性药治疗效果最接近，说明黄芩川贝母配伍后药效更佳；与模型组相比，黄芩组、川贝母组、黄芩-川贝母组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α均有不同程度的下降，且配伍后效果最佳，说明黄芩川贝母可协同改善小鼠肺部炎症。

表2 各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平

图2 各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平Fig.2 IL-1β,IL-6,TNF-α levels in serum of mice in each group

3.3.3 各组小鼠肺组织切片病理形态变化

各组小鼠肺组织病理切片如图3所示。由图中可以看出，LPS组的小鼠肺组织出现了明显的病理学损伤，表现为不同程度的炎性渗出、红细胞渗出、结构紊乱等，而经过治疗后，症状明显改善，且黄芩川贝母配伍组效果最佳。

4 讨论与结论

肺炎是指终末气道、肺泡及肺间质的炎症，由病原微生物感染、理化免疫因素、过敏和药物导致[10]，病原微生物包括由细菌、病毒、真菌、寄生虫等，最常见的是由细菌引起的肺炎[11]。肺炎是全球发病率和死亡率的主要原因，每年有4.5亿病例，有近156 00万儿童感染过肺炎，约有130万儿童及160万60岁以上的成年人死亡[12-14]。

肺部发生感染或损伤时，会发生复杂的细胞因子网络，当IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子过度释放时，形成炎性细胞爆发，毛细血管的通透性发生改变，导致内毒素大量蛋白进入肺泡，肺泡表面被破坏，病情急剧恶化[15]。因此及时抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子过度表达，在治疗肺炎过程中尤为关键。

图3 各组小鼠肺组织病理切片染色结果(HE，×40)Fig.3 Staining results of lung tissue pathological sections of each group of mice (HE,×40)注：A：空白组；B：LPS组；C：阳性药组；D：黄芩组；E：川贝母组；F：黄芩-川贝母组。Note:A:Control group;B:LPS group;C:Treatment group;D:SR group;E:FCB group;F:SRFCB group.

目前西医在治疗肺炎所采用抗生素、糖皮质激素及鼻管吸氧等辅助治疗，效果显著，但随着抗生素的大量使用，导致病原体耐药性加强，激素也可产生多种副作用，这使肺炎成为临床治疗中比较棘手的疾病[16]。中医治疗肺炎建立在辨证论治的基础上，各医家采用不同的治法，多以清热解毒、开肺化痰、止咳平喘为基本治疗原则[17]。黄芩川贝母配伍具有清热解毒、止咳平喘的功效，多用来治疗呼吸系统疾病[18,19]。

本文对3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、2∶3、1∶3、0∶3比例的黄芩川贝母水提液中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素含量进行测定。结果发现，二者配伍比例在3∶1～2∶3之间时，四种化学成分的溶出率变化较小，当配伍比例达到1∶3时，其总含量下降了23.7%。因此黄芩川贝母在配伍应用中，其配伍比例不宜超过2∶3，此结果与《四圣心源》、《医学摘粹》、《医学探骊集》中记载的应用比例范围相符。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，已经被广泛应用诱导肺炎、急性肺损伤等炎症模型[20-22]。通过研究黄芩川贝母配伍前后对LPS诱导肺炎小鼠模型的抗炎作用发现，黄芩川贝母配伍可显著降低小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量、改善肺组织病理形态，其治疗效果优于单味药组，二者在抗LPS诱导的肺炎中具有协同增效作用。

本研究从化学成分含量变化、抗肺炎活性两个角度探究了黄芩川贝母配伍应用的合理性及科学性，为其临床应用提供了一定实验依据。同时本文对黄芩川贝母配伍的初步探索，可为后续深入探究二者配伍比例、量效关系等研究奠定基础。