非编码RNA在生防菌-植物线虫-寄主互作中的研究进展

陈立杰 杨帆 范海燕 赵迪 王媛媛 朱晓峰 刘晓宇 段玉玺

（1. 沈阳农业大学植物保护学院 设施园艺教育部重点实验室（沈阳农业大学），沈阳 110866；2. 沈阳农业大学分析测试中心， 沈阳 110866；3. 沈阳农业大学生物技术学院，沈阳 110866；4. 沈阳农业大学理学院，沈阳 110866）

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不编码蛋白质的RNA，包括rRNA，tRNA，snRNA和microRNA 等多种已知功能的 RNA，还包括未知功能的circRNA和lncRNA等。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物学功能。其中microRNA（miRNA）、circRNA和lncRNA是目前生物学领域主要的研究热点。

植物线虫可危害多种蔬菜作物，是世界上最难防治的土传病原物，线虫通过其分泌物诱导和调节寄主植物的细胞发育为自己建立专门的巨细胞，从而为其不断地供应营养，建立稳定的互作关系。生防菌指那些可以防治植物病害的各种微生物，包括细菌、真菌和放线菌等。生防菌可有效控制线虫危害，并激发植物对线虫的免疫机制，一直是研究的热点。而生防假单胞菌（Pseudomonas）是防治作物根结线虫病的重要生防菌，如荧光假单胞菌（P. fluorescens）［1-2］和恶臭假单胞（P. putidaSneb821），具有毒杀线虫、诱导番茄抗性和促生长等多方面作 用［3］。Yang等［4］研 究 发 现ncRNAs中miRNA、lncRNA和circRNA等响应恶臭假单胞Sneb821激发番茄免疫抗南方根结线虫的侵染，预测到lncRNA44664关 联 到miR396/GRFs，lncRNA48734关联到miR156/SPL，这些发现为生防细菌诱导番茄抗根结线虫侵染的机理提供了新的分子调控模型。为探究ncRNAs在植物与线虫互作过程中的作用以及植物、病原物和生防菌三者之间的关系，本文阐述了植物线虫、生防假单胞菌与寄主互作中ncRNA的研究进展，剖析植物线虫病害研究中ncRNAs发挥何种作用，旨为植物线虫学理论研究新领域添砖加瓦。

1 miRNA 响应植物线虫胁迫和假单胞菌诱抗的研究进展

1.1 miRNA响应植物线虫胁迫的研究进展

ncRNAs中只有miRNA在植物线虫领域研究较多，也是最早被鉴定到参与免疫反应的小RNA分子。miRNA的主要功能是通过引起靶基因mRNA的降解或者阻止靶基因mRNA的翻译，进而抑制靶基因 功能［5］。

植物寄生线虫如胞囊线虫和根结线虫会在寄主根系形成特殊的取食细胞如合胞体和巨细胞，是寄主细胞的基因被额外诱导表达形成的新型取食细胞，其中miRNA发挥了作用［6］。miR396在拟南芥和大豆中靶向生长调控因子GRF，在植物线虫侵染寄主形成取食细胞时通过调节GRF1、GRF3［7］和GRF6、GRF9［8］等基因表达而影响取食细胞的发育，证实miR396/GRF分子模型调控取食细胞形成的作用具有保守性。Cabrera 等［9］证明miR390a和TAS3在根结和巨细胞中可共表达，根结形成过程需要 miR390/TAS3/ARF3 分子模型调控。Zhao 等［10］发现番茄的 miR319/TCP4 和miR396/GRF 潜在的交互作用可能介导了对根结线虫的抗性。Díaz-Manzano等［11］研究发现miRNA172/TOE1/FT基因调控模型在爪哇根结线虫侵染拟南芥的巨细胞形成和发育过程中通过修饰生长素而起到重要作用。

拟南芥接种胞囊线虫后，miRNA及其靶基因呈负调节关系，其中miR156、miR159、miR172和miR396 表达量下调［6］。miR159不但自身可以受到生长素诱导，它还可以调控 MYB33和 MYB65的表达［12］，并参与调控抑制了寄主根结中靶基因MYB33的表达从而限制南方根结线虫的早期侵染［13］。Pan等［14］分析miR159-MYB，miR319-TCP4 和 miR167-ARF8 三对基因调控模型的逆表达方式可能响应了南方根结线虫侵染棉花根系的胁迫反应。

1.2 miRNA响应假单胞菌诱抗的研究进展

拟南芥 miR393 是第一个在植物免疫应答过程中起关键作用的 ncRNA，被丁香假单胞菌鞭毛蛋白 flg22 诱导激发，miR393、miR160 和 miR167 通过抑制生长素信号途径而影响细菌的侵染［15］。Flg22 是被用于 PTI（PAMP-triggered immunity，PAMP 触发免疫）体系中重要的元素可诱导胼胝质沉积，但是人们对 PTI 在根系上的作用，尤其是在植物与线虫互作中作用知之甚少。Lee 等［16］证明了来源于丁香假单胞菌的 RNA 激发了拟南芥的先天免疫反应。细菌侵染拟南芥后 miR398a 和 miR773 表达量降低，调控靶基因 SOD 上调表达来抵抗细菌侵染。miR858-MYB83调控系统被证明具有平衡甜菜胞囊线虫对拟南芥致病性的优异分子功能［17］。我们的研究也发现lncRNA48734-miR156-SPL和lncRNA44664-miR396-GRF也参与了生防假单胞菌Sneb821调控的番茄抗南方根结线虫侵染的生物学过程［4］。

Święcicka等［18］研究证实miRNA与NBS-LRR和激酶接受子家族RLKs成负相关性，显示miRNA介导的R基因抑制可能是马铃薯金线虫致病番茄的关键调控因子。NBS-LRR（nucleotide binding siteleucine rich repeat，甘氨酸结合位点和亮氨酸富集重复）结构是迄今从植物中克隆到的最大一类抗病基因，NBS-LRR介导了植物对专性和半专性寄生病原物的抗性［19］。番茄基因组中NBS-LRR基因家族中CNL（CC-NBS-LRR）亚家族成员扩展程度大于TNL（TIR-NBS-LRR）亚家族，已克隆的番茄抗爪哇根结线虫Mi-1、Mi-9和抗马铃薯白线虫Gpa2基因都属于CNL亚家族，而番茄中抗马铃薯金线虫Hero抗病基因和小麦中抗燕麦胞囊线虫的抗病基因Cre3和Cre1属于NL（NBS-LRR）亚家族［20-21］。陆秀红等［22］初步从番茄中获得2条具有NBS-LRR保守结构域的序列，F5-8与Mi-1相应区域氨基酸相似，F5-20与Hero基因相似。番茄通过lncRNA23468-miR482b-NBS-LRR调控模式抵抗致病疫霉的侵染［23］。生防芽胞杆菌AR156诱导了拟南芥抗PstDC3000的侵染，是miR825和miR472受到抑制从而增强NBSLRR基因家族CNLs介导基础免疫而实现的［24-25］。有人提出了NBS-LRRs和miRNAs的共进化模型假设，是植物平衡NBS-LRR 抗病基因的收益与成本的结果［26］。

2 lncRNA和circRNA 对植物病原物胁迫的响应

2.1 lncRNA对植物病原物胁迫的响应

lncRNA是一类长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。Zhang等［27］研究了棉花响应病原真菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）的lncRNA表达谱，功能分析显示两个core lncRNAGhlncNAT-ANX2与GhlncNAT-RLP7沉默的幼苗对病原真菌的抗性增强，可能与LOX1和LOX2的表达增加有关。我们前期的研究表明，lncRNA48734和lncRNA44664可能参与到番茄的免疫激活过程当中［4］。Qin等［28］鉴定到一个lncRNA（DRIR）在干旱和盐胁迫下起到正调节作用，过表达DRIR基因的拟南芥突变体具有抗旱耐盐的能力。lncRNA-At5NC056820 过表达转入拟南芥中，转基因植株能够在一定程度上提高拟南芥的耐旱性［29］。番茄的lncRNA23468-miR482b-NBSLRR调 控 模 式［23］和WRKY1-lncRNA33732-RBOH模型调控H2O2积累［30］，也是通过ncRNAs调控番茄生物学过程从而达到抗病的作用。

2.2 circRNA对植物病原物胁迫的响应

circRNA（环状RNA）是一类由前体mRNA选择性剪切产生，3'和5'末端共价结合形成环状单链闭合的ncRNA，最早于20世纪70年代在马铃薯纺锤块茎类病毒病样中被首次发现［31］，但由于大多低丰度表达、闭环结构等特点而不被认识。2013年Memczak等［32］利用高通量测序技术分别在人、小鼠和线虫中确定了成百上千个circRNAs的存在，而后研究者在各类生物中陆续挖掘到circRNA并鉴定其功能，使其成为RNA研究领域的又一个新征程［32-34］。circRNA 作为 miRNA 的“海绵”及竞争性内源 RNA 结合胞内 miRNA，阻断miRNA 对其靶点 mRNA 的抑制作用，从而调节基因表达［35］；或与调控元件结合、或与蛋白互作调控基因的转录［36］；也可影响亲本基因的选择性剪切和表达水平［37］；并参与多种生物学过程，在植物生长发育和胁迫应答过程中发挥特殊作用［33，38-40］。

自 2014 年在模式植物拟南芥中首次发现植物 circRNA 以来，在水稻和番茄等十余种植物上有所研究，近3年人们开始关注生物胁迫下 circRNA 作用。如研究发现 circR5g05160 激发了水稻免疫抗稻瘟病菌侵染［41］。有 3个 circRNA 基因与甜瓜蔓枯病抗性相关［42］。马铃薯中发现了circRNA可能通过作为 miRNA “海绵”来调节对马铃薯软腐病菌的免疫应答［43］。lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA 调控网络在西瓜响应 CGMMV（黄瓜绿斑驳病毒）侵染中发挥重要作用［44］。

3 总结与展望

植物受病原物胁迫时，lncRNA和circRNA多通过 miRNA 调控 mRNA 起作用，但目前所鉴定的 circRNA 数据量远远不够，而且生物学功能未知太多，因此需要大量研究深入挖掘和证明 circRNA 的生物学功能与作用。

人们利用拟南芥突变体验证了干扰miRNA和siRNA途径会增加寄主对根结线虫和胞囊线虫的抗性［13，45-46］。Huang等［47］在拟南芥中表达了南方根结线虫（M.incognita）16D10基因的发夹结构RNA发现，转基因植株的根结线虫数量下降了63%-93%。Steeve等［48］利用大豆胞囊线虫中的RNAi机制，以编码线虫中特异蛋白MSP的基因为靶基因，在转基因大豆中表达相应的siRNA（small interfering RNA）使转基因大豆根中胞囊线虫数量减少了68%，此外，残存线虫后代的繁殖能力也大大减弱。

RNAi作为一种新工具用于植物线虫病害的防控正在被研究，但是距离真正应用还有一段距离。miRNA 是根际中植物与微生物互作和微生物群落形成的关键媒介，通过共进化，植物与相关微生物构成的共生有机体建立了跨界双向通信通道［49］。干扰 miRNA 合成或分解途径会增加寄主对线虫的抗性［13］。对于根结线虫这种高等的植物专性寄生物，RNAi 干扰可能会起到类似农药的防治作用，而来源于生防菌调控的寄主 RNA 或有益微生物本身的 RNA，将来是否能够作为防控植物线虫病害的因子？2021年2月，中国科学院微生物研究所郭惠珊课题组提出利用有益微生物表达小 RNA，靶向病原菌关键致病基因的植物保护新方法［50］，也为线虫生防菌的利用拓展了新思路。此外，Panstruga［51］认为细菌的RNA也可以作为一种新型的MAMP激发植物免疫反应。也有研究表明，蜡质芽孢杆菌AR156 可以通过激活MAPK 通路诱导拟南芥产生系统抗病性，并且一些miRNA在其中起到一定作用［52］。因此，深入研究和理解ncRNAs 在植物线虫与寄主互作中的调控作用将为利用ncRNAs防控线虫病害提供新思路。

ncRNAs的研究刚刚兴起，目前的研究结果多显示其参与了各种胁迫条件下植物的免疫响应，尤其是在线虫的生物胁迫和假单胞菌的免疫激活方面研究逐渐增多。因此，假单胞菌作为生防菌激发植物对根结线虫的RNA免疫调控机制研究将会为复杂精致的免疫调控分子机理提供新线索。