植物激素对植物寄生线虫取食位点建立与发育的影响

黄文坤 于敬文 贾建平，2 彭德良

（1. 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2. 甘肃农业大学植物保护学院，兰州 730070）

植物寄生线虫包括内寄生线虫（endoparasistic nematodes）和外寄生线虫（exoparasitic nematode）两大类，其中根结线虫（Meloidogynespp.）和孢囊线虫（Heteroderaspp.）是对农业生产危害最大的两类内寄生线虫，能感染大多数农作物［1］。内寄生线虫在植物根部诱导形成复杂的取食结构（feeding sites），线虫依赖这种取食结构汲取营养，其中根结线虫诱导形成巨细胞（giant-cells）、孢囊线虫诱导形成合胞体（syncytium）［2］。根结线虫具有多食性，为了完成巨细胞的发育，可以与大多数植物的生理活动互作，它们能够“掠夺”植物基础发育所需要的营养，如须根形成所需要的诱导物质。为了明确未感染线虫的植物根部发育过程中的信号介导过程，通过组学技术发现成百个基因在植物与线虫互作过程中的特异表达［3］。已有证据表明，植物寄生线虫取食细胞的发育通过模拟或干扰植物已有的发育机制来进行。

植物激素（phytohormones）是调节植物生长和发育的小型信号分子。除5种典型的植物激素：生长 素（auxin，IAA）、乙 烯（ethylene，ETH）、细胞分裂素（cytokinin，CTK）、赤霉素（gibberellin，GA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）外，最近又发现了几种激素：油菜素类固醇（brassinosteroids，BRs）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水杨酸（salicylic acid，SA）和独脚金内酯（strigolactones，SL）。上述植物激素参与调节许多植物生长过程，包括器官形成、分生组织功能和远程信号传递等［4］。其中植物生长素能够诱导分生组织中的细胞分裂；乙烯能够促进线虫取食位点形成；细胞分裂素能够促进分生组织中的细胞分化；赤霉素促进分生组织发育及成熟；多肽类激素则参与阻碍植物细胞正常发育并介导线虫取食位点的形成。植物激素在协调植物对互利或寄生生物的信号反应过程中起关键作用，这些生物体通过控制特定细胞类型的激素平衡与宿主建立起亲密的互作关系。诱导线虫取食部位的主要信号是分泌蛋白释放到巨细胞（合胞体）中，诱导多核细胞复合物发挥营养库的作用，这些取食位点的形成是植物基因表达的巨大变化和分化根细胞重组的结果。由于植物激素是参与基因转录调控的重要因素，因此直接或间接调控局部激素平衡是线虫改变植物细胞基因表达模式的重要途径。本文重点讨论了植物激素在孢囊线虫和根结线虫形成取食位点的分子机制中的重要作用。

1 线虫取食位点建立与形成

1.1 根结线虫取食位点的发育

根结线虫通过单个细胞扩张形成的取食细胞称为巨细胞。巨细胞通常由围绕线虫前端的中柱内的薄壁细胞形成，食道腺分泌物是刺激巨细胞形成的主要分子，这些分泌物是从线虫口针中释放、刺穿细胞壁并与植物细胞膜接触在膜上形成一个微小的孔，以便进入被寄生细胞的细胞质进行取食。早期研究发现根的中柱细胞和皮层细胞在线虫周围增殖，增加了根的周长［5］。如Wyss等［6］研究发现根结线虫幼虫通过穿透和破坏表皮细胞进入根部靠近根尖的伸长区，随后迁移到分生组织，最后回到维管组织中，其头部在靠近维管组织的伸长区进行取食。随着取食部位的发展，它们表现为根上的膨大区域称为根结。

巨细胞在取食位点形成血管状组织网络并且细胞壁向内生长以便获得营养物质，而植物根系木质部和韧皮部都是巨细胞营养的贮存场所。在巨细胞中线虫将获得的营养物质储存在富含蛋白质和脂类物质的细胞质中［7］。此外，根结线虫诱导巨细胞细胞壁加厚、松弛来达到扩张的目的，并形成内生组织以增加质膜表面积来增加线虫取食位点食物的获取［8］。这种与巨细胞的扩张和功能相关的细胞壁改变是由宿主基因的诱导调节所介导的。根结线虫诱导的巨细胞的细胞壁经过结构修饰其主要成分中含有高甲酯HG型果胶、木葡聚糖和阿拉伯聚糖［9］。巨细胞的关键特征包括：大量的细胞核（由无胞质分裂的重复核分裂形成）、大量的次生细胞壁向内生长（增加取食位点的表面积）和大量的细胞器包括高尔基体堆、小液泡、质体、内质网和线粒体。新形成的巨细胞含有大液泡，占细胞体积的很大一部分，而成熟的巨细胞含有小液泡，并且大部分细胞内含物是细胞质［10］。

1.2 孢囊线虫取食位点的发育

不同种类的孢囊线虫改变了植物的发育途径，从而有利于其取食位点的发育。孢囊线虫细胞壁破裂后细胞融合而产生的多核取食细胞称为合胞体，合胞体是由相邻细胞原生质体融合形成的，它的发育是由孢囊线虫二龄幼虫从皮质或薄壁细胞中选择的单个细胞开始的［11］。当根系处于初级生长状态时，孢囊线虫二龄幼虫侵入主根和侧根的伸长区或根毛区。当根处于次生生长状态并被多层外皮层或周皮覆盖时，则很少有孢囊线虫侵入侧根形成区。

合胞体是孢囊线虫侵染寄主后的唯一营养来源。合胞体通过在皮层细胞和内胚层细胞之间形成细胞壁开口进而向微管束扩散，这一部分被称为“皮层桥”［12］。在合胞体中细胞质增大，液泡体积缩小，细胞核和核仁增大，内质网、核糖体、质体和线粒体含量丰富。合胞质显著增长且流动性增加表明其代谢活动增强。合胞核增大，核仁增大，质体（前质体和淀粉体）和线粒体在合胞质中迅速增殖。合胞体细胞壁会被线虫食道腺通过针孔释放的细胞壁修饰蛋白混合物软化。合胞体细胞壁显著增厚，合胞体细胞壁在孢囊线虫取食位点的发育有两方面作用［13］：一方面，合胞体细胞壁维持合胞体内的渗透压；另一方面，合胞体细胞壁保持柔韧性和渗透性，柔韧性扩大取食位点和融合新细胞，渗透性促进和维持合胞体对线虫取食所需的营养素的吸收。

2 植物激素相关基因在线虫取食位点的表达与调控方式

对差异表达的基因序列进行聚类分析表明，线虫取食位点形成过程中的基因表达与植物激素有关。对孢囊线虫［14］和根结线虫［15］感染的植物组织的研究结果表明，植物激素在基因表达的调控和取食位点的建立中起着重要作用。

2.1 植物激素相关基因的表达方式

基因筛选和功能表征揭示了负责生长素、乙烯、细胞分裂素、赤霉素和茉莉酸识别的受体以及某些肽激素的受体参与感知蛋白质和信号传递［16］。通过比较不同植物激素的相关受体，我们发现膜相关受 体CRE1、BRI1和ETR1/ETR2/EIN4/ERS1/ERS2分别感知细胞分裂素、油菜素类固醇和乙烯，并激活已知的信号传递。相比之下，细胞核受体TIR1、GID1和COI1分别涉及生长素，赤霉素和茉莉酸信号，以及泛素-蛋白酶体途径［17］。许多对线虫差异表达的基因都与生长素和乙烯相关，少数基因与赤霉素、细胞分裂素和脱落酸相关［18］。研究发现孢囊线虫诱导的合胞体过程中生长素和乙烯在取食位点发育过程中发挥作用，多肽类激素也参与了合胞体的形成［19］，植物生长素与细胞分裂素的交互作用是植物根发育中激素调节的主要方式，包括根端分生组织（RAM）的产生、须根的形成及维管束组织的发育等［20］。线虫通过干扰上游植物激素合成的信号传导来改变植物基本结构发育。实验结果显示，在根结线虫诱导的根结中检测到植物生长素及其前体的浓度增加，表明植物生长素在根内诱导形成的巨细胞发育过程中发挥重要作用［21］。质谱分析结果显示，在甜菜孢囊线虫（Heterodera schachtii）与南方根结线虫（Meloidogyne incognita）的口针分泌物中能够检测到植物生长素及细胞分裂素，表明两种激素在线虫取食位点的发育中起作用［22］。而且，通过使用报告基因的植物激素感应系统，证明了植物生长素及细胞分裂素相关基因在巨细胞、根结及合胞体的形成和发育过程中被激活。上述实验结果表明植物激素通过相关基因特异性表达适应线虫取食位点形成。

2.2 植物激素相关基因的调控途径或作用

病原物干扰植物生理活动的分子机制能有效地改变植物的发育途径，能够促进开花控制蛋白降解的植原体毒性蛋白SAP54，在发育过程中能够产生短暂的信号使花发育成叶，从而更好地吸引叶面媒介昆虫有利于植原体的发育和繁殖。同样，线虫分泌的效应子也能干扰植物的发育途径［23］。蛋白质组学、转录组学和比较基因组学的发展促进了线虫分泌的效应子的鉴定。鉴定结果表明线虫效应子改变根细胞中的基因表达，可能干扰寄主植物转录因子的活性，诱导植物激素相关基因在线虫取食位点进行调控［24］。

2.2.1 线虫取食位点中生长素介导的调控途径 根结线虫感染使植物激素相关基因转录激活或抑制，导致内源激素水平发生局部变化。对取食位点发育的生化研究表明，南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫等形成的根结中出现吲哚类化合物的积累［21］。此外，通过早期激活生长素反应启动子GH3［25］和合成生长素反应启动子DR5［26］，可以检测到线虫取食位点中局部生长素水平的增加。DR5启动子是植物根系生长素水平变化的标志，因为其含有来自GH3的多种生长素反应元件（AuxRE）［27］这种生长素反应元件由生长素反应基因所必需的5'-TGTCTC-3' DNA碱基序列组成［28］。由ARF（生长素响应因子）多基因家族编码的蛋白质与生长素反应元件5'-TGTCTC-3'的DNA碱基序列结合，导致生长素相关基因表达的激活或抑制。

2.2.2 线虫取食位点中乙烯介导的调控途径 筛选出的乙烯敏感性降低的拟南芥突变体表明，乙烯介导的信号转导在孢囊线虫诱导的取食位点发育中发挥重要作用［29］。在线虫诱导的取食部位，乙烯介导的信号转导通过将植物转录因子家族EREBPs［30］与乙烯反应启动子元件GCC盒结合导致乙烯反应基因表达的转录激活。etr1-1编码一种位于内质网膜上的双组分组氨酸激酶类受体，在感染显性乙烯不敏感突变体etr1-1后，甜菜孢囊线虫的发育明显减弱。突变体不能与乙烯结合，这表明ETR1对乙烯的感知和下游信号转导对合胞体形成起到重要作用。ein2突变体作用结果表明EIN2（ETHYLENE INSENSITIVE2）作为受体-CTR1复合物是乙烯信号通路的正调节因子［31］，ein2突变体的感染也导致线虫发育停滞。ein3突变体作用结果表明其编码参与核内乙烯反应放大的转录因子ein3［32］。

2.2.3 线虫取食位点中细胞分裂素介导的调控途径 生物测定结果表明，根结线虫可以产生具有生物活性的细胞分裂素［33］。Lohar等［34］利用细胞分裂素氧化酶基因的转基因表达直接调控细胞分裂素，实验表明根结线虫诱导的取食部位数量与细胞分裂素水平之间具有相关性。在转基因植物中使用ARR5启动子驱动报告子结构，当根结线虫幼虫到达分化的维管束（巨细胞诱导部位）时，ARR5表达增强。在巨细胞诱导的部位中细胞分裂素应答基因ARR5在分化维管束中强烈表达时，细胞分裂素在植物-根结线虫相互作用中的积极作用明显增强。在巨细胞中该基因在线虫虫瘿成熟过程中被抑制，表明细胞分裂素可以在增强和抑制细胞分裂中发挥作用。细胞分裂素在巨细胞形成中的作用的直接证据是细胞分裂素氧化酶在根中的瞬时表达，该酶负责细胞分裂素的降解，导致寄主植物对根结线虫抵抗力增强［34］。研究表明在显微解剖的巨细胞中，观察到细胞分裂素信号负调控因子普遍下调［35］。结合上述观察，外源细胞分裂素的应用［36］表明在巨细胞的起始阶段对细胞分裂素的需求是短暂的。

2.2.4 线虫取食位点中赤霉素介导的调控途径 番茄对植物寄生根结线虫适应性反应转录谱的研究表明，在寄生过程中，编码赤霉素（GA）2-氧化酶样蛋白的基因转录上调［37］。GA2-氧化酶是参与赤霉素失活的酶，赤霉素失活是一个复杂和严格调控植物细胞伸长的过程。其基因转录的上调可以反映根结线虫侵染期间活性赤霉素水平的降低，研究发现在孢囊线虫与拟南芥的相互作用中，赤霉素氧化酶的诱导模式亦是如此［38］。因此，赤霉素调节的信号可能是植物对植物寄生线虫的共同反应。此外，南方根结线虫诱导的水稻根部巨细胞的转录分析表明［39］，与未感染线虫细胞相比，巨细胞中下调幅度最大的基因为参与赤霉素分解代谢的赤霉素2-β双加氧酶的转录本，而参与赤霉素降解的基因也因为控制赤霉素内部动态平衡的反馈效应而被诱导。

2.2.5 线虫取食位点中多肽类激素介导的调控途径 线虫参与编码和分泌植物多肽类激素。甜菜孢囊线虫的SYV-46肽可能编码了一个CLE样配体［40］。SYV-46蛋白从SCN花柱分泌蛋白质［41］在寄生植物中起直接作用。SYV-46蛋白作为一个CLE不仅能与CLV2结合，而且还能够与拟南芥CLV3-1突变体互补［42］。与大豆孢囊线虫SYV-46蛋白一样，南方根结线虫16D10是一个未知蛋白，但序列分析表明其包含编码CLE类分泌蛋白的功能区［43］，16D10的转基因表达对根的发育有重要影响。对日本莲藕的遗传分析表明，CLV1类受体har-1在控制南方根结线虫［44］形成的根结数量时起着重要作用［45］。

3 植物激素对线虫取食位点建立与形成的 影响

由于植物激素在协调植物对寄主植物和寄生线虫的反应中起着关键作用，植物寄生线虫可以通过调节激素平衡来促进其高度专化的取食结构形成［46］。在植物寄生线虫建立的取食位点中观察到生长素、乙烯、细胞分裂素等激素信号的变化，这些植物激素信号变化是线虫虫瘿完成发育和汲取营养所必须的。

3.1 植物生长素诱导分生组织中的细胞分裂

生长素（吲哚-3-乙酸）是一类植物次生代谢物，参与许多发育过程能够诱导分生组织中的细胞分裂。生长素进入细胞依赖于质子泵，生长素的电子通量及其在各种组织中的分布是由PIN蛋白介导的。部分证据表明植物须根与线虫取食位点发育过程具有相似性及分子水平的联系，在植物须根的形成过程中PIN蛋白引起植物自身生长素水平增加［47］。在爪哇根结线虫（M. javanica）和花生根结线虫（M. arenaria）的根结中可以检测到启动子驱动GFP表达LBD16的基因，它能够被生长素的阻抗剂PEO-IAA抑制，实验结果表明根结中需要有定量的生长素才能使LBD16 表达［48］。在根结线虫和孢囊线虫中诱导表达的WRKY23是另一种受生长素调控的相关基因，在线虫取食位点或须根形成过程中，WRKY23 在SLR/IAA14（生长素反应因子）- ARF7/ ARF19信号通路的下游起作用，参与须根发育过程中刺激局部的类黄酮生物合成［49］。与线虫的分泌物激活LBD16的表达类似［50］，线虫相关的信号调控WRKY23的表达在线虫取食位点中通过独立的生长素途径激活。

3.2 乙烯促进取食位点形成

乙烯作为一种简单的气态化合物，可以在植物细胞应对生物或非生物胁迫时产生。当受到线虫侵染时，植物根部细胞会产生乙烯，这是对生物胁迫的辅助反应［51］。乙烯过多突变株eto1、eto2和eto3导致孢囊线虫感病性增加［29］，表明乙烯水平的增加促进了根部合胞体的发生。对乙烯相关的突变体功能分析进一步表明乙烯在植物与线虫互作过程中的重要性：一方面乙烯过量表达的突变体eto2和eto3更加容易感染孢囊线虫；另一方面，乙烯信号通路中的突变体tr1-1，ein2-1，ein3-1，eir1-1和axr2对孢囊线虫的感病性降低［29］。研究表明乙烯合成及信号相关的基因如编码膜受体的ACC氧化酶或ACC合成酶在取食位点中诱导表达［52］。组织学分析显示，在取食结构的扩大和相邻细胞间的合胞体细胞壁溶解增强的过程中乙烯起到主要作用［53］。

3.3 细胞分裂素促进分生组织中的细胞分化

细胞分裂素作为一类嘌呤类分子参与分生组织细胞分裂，通过对细胞周期的影响能够促进分生组织中的细胞分化［54］。在细胞周期中，细胞分裂素可以在G1/S期转变时起作用［55］。研究表明根结线虫可以产生具有生物活性的细胞分裂素［56］。激光共聚焦分析表明水稻根结线虫（M. graminicola）巨细胞调控生长素与细胞分裂素浓度平衡［57］。在巨细胞中，26%的生长素相关基因特异表达，而在合胞体中，21%的分裂素相关基因被诱导表达。相反，巨细胞中细胞分裂素相关基因被抑制的数量更多；而合胞体中分裂素上调的相关基因数量更多［58］。

3.4 赤霉素促进分生组织发育及成熟

赤霉素是细胞分裂和伸长的重要刺激因子，研究表明赤霉素通过影响双子叶植物和单子叶植物叶片组织中的Della蛋白家族，在控制和协调细胞分裂、细胞扩张等方面发挥着重要作用［59］。与该研究类似的是，在番茄和水稻南方根结线虫的巨细胞中及大豆孢囊线虫形成的合胞体中，普遍增强了赤霉素合成或反应相关基因的表达水平［60］。赤霉素在刺激细胞分裂和伸长方面起着重要作用。在对水稻根结线虫侵染引起的转录重组研究中发现，线虫形成的根结中上调最强的基因是脂转移蛋白（LTP）基因家族的赤霉素（GA）受体GID1L2，并有研究证明赤霉素（GA）受体GID1L2在巨细胞中被强烈诱导表达［61］。此外，Klink等［62］观察到大豆孢囊线虫 （H. glycines）合胞体中赤霉素生物合成基因的上调和赤霉素代谢相关基因的显著激活，GA20-氧化酶1和2两个关键的氧化酶催化赤霉素生物合成。这些观察表明赤霉素在巨细胞的发育、维持和成熟过程中起着重要的作用。

3.5 多肽类激素阻碍植物细胞正常发育

多肽类激素在植物生长发育中起着重要作用，植物编码大量的跨膜受体激酶，这些激酶能感知激素配体。研究发现南方根结线虫16D10基因包含编码CLE类的分泌蛋白序列，而16D10基因阻碍植物细胞正常发育。此外，在孢囊线虫中也发现了与CLAVATA3/胚乳周围区域相关的多肽（CLE）具有阻碍寄主植物生理的作用。目前已在大豆孢囊线虫、甜菜孢囊线虫、马铃薯金线虫（Globodera rostochiensi）中发现更多的CLE类基因［63］。通过对CLE类进行基因沉默或对基因沉默植株接种线虫后进行功能分析，发现大豆或拟南介中线虫侵染率下降，合胞体体积变小［64］。综上所述CLE类多肽在合胞体和巨细胞发育中起到抑制作用。

4 展望

植物激素通常起到活化剂或拮抗剂的作用，从而起到增强或抑制活性的效果。生长素的增加可能导致乙烯的产生，而细胞分裂素抑制生长素信号和运输。最近对线虫取食位点发育的高通量研究表明，各种激素介导的信号通路之间的相互作用导致激素相关基因的差异表达。植物激素在线虫取食位点形成过程中通常是协同作用的，并在建立取食位点和将根细胞重组为专门的取食结构中起到关键调节作用。在大豆、番茄和拟南芥等不同植物中，生长素和乙烯等激素在孢囊线虫合胞体形成中的作用相似。植物β-内葡聚糖酶启动子中ABA和GA反应元件在合胞体发育过程中上调［65］，表明这两种激素都可能参与调节细胞壁的改变。因此，可以推测植物激素在不同植物的根结线虫巨细胞发育过程中具有相互调节作用，未来通过高通量转录组测序和功能研究，将有助于揭示巨细胞和合胞体发育过程中不同植物激素的调控作用。

除了传统的植物激素外，新的激素如独脚金内酯［66］、肽激素CLEs［67］、茉莉酸［68］和水杨酸在线虫取食位点形成中的作用值得一提。近年来研究表明，独角金内酯是生长素的长距离信使［69］，在根瘤菌结瘤过程中起着重要作用。而根瘤菌结瘤和线虫取食位点发育有着相似的反应，并且存在重叠的信号通路。同样我们推测独脚金内酯在内寄生线虫诱导的取食位点发育中也起着类似的作用。多肽类激素CLEs调节许多植物生长过程，包括器官形成、分生组织功能和远程信号传递［70］，多以阻碍植物细胞正常发育进而介导形成取食位点发挥作用。大豆孢囊线虫诱导合胞体的转录组基因表达分析表明，受生长素、乙烯、赤霉素、茉莉酸和细胞分裂素等一系列激素控制的基因表达存在差异［71］。水杨酸作为根结线虫成功诱导或维持取食位点的重要激素在寄主植物生长发育中起重要作用，控制寄主植物对寄生线虫的防御反应。最新研究表明，在线虫侵染的不同时间段，水杨酸途径的基因在拟南芥和水稻的巨细胞和根瘤中普遍受到抑制，而接种南方根结线虫后水杨酸途径的正调控因子NPR1的过表达导致寄主植物根瘤和卵块的数量减少［72］。

对植物分子特征变化的研究是了解植物与线虫互作的基础，有助于充分了解正常的植物细胞如何重组形成取食位点的细胞，也有助于明确线虫效应子在与其它植物激素互作中的功能，最终明确它们在干扰植物发育过程中的作用，从而为构建抗线虫的植株、研究特殊的线虫防治策略提供有力的技术支撑。