养阴清肺丸微生物限度检查方法适用性研究

王 静 张秀花 任仲丽 盛春雷 闫世生

山东省菏泽市食品药品检验检测研究院，山东菏泽 274000

养阴清肺丸由地黄、麦冬、玄参、川贝母、白芍、牡丹皮、薄荷、甘草八种中药组成。作为补益剂，具有养阴润燥，清肺利咽之功效[1-2]，主治阴虚肺燥，咽喉干痛，干咳少痰或痰中带血[3]。在2019年山东省风险监测30 批次样品检验过程中，通过4个企业提供的微生物限度检查方法适用性试验资料发现，微生物限度检查适用性试验均存在方法差异，因此，通过方法适用性试验来确定检验方法的可行性和有效性是十分有必要的[4]。《中国药典》2015年版方法较之前发生了较大变化，所以为了检验结果的准确可靠，样品检验时需要重新建立合适的检验方法[5-6]，并且《中国药典》2015年版是目前常用的一种药品质量卫生检验方法[7]，为确保其微生物限度检查质量安全性达到要求[8]，本研究按《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1105、1106[9]，建立养阴清肺丸微生物限度方法适用性试验，确保检测方法的可行性及统一性。

1 仪器与试药

1.1 样品

北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号为17035288；颈复康药业集团赤峰丹龙药业有限公司，批号为1705052；呼伦贝尔松鹿制药有限公司，批号为181213；山西华康药业股份有限公司，批号为2019 0202。

1.2 培养基与稀释液

胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基（批号：190518）、沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基（批号：190625）、胰酪大豆胨液体（TSB）培养基（批号：190712）、麦康凯琼脂（MACa）培养基（批号：170925）[9]、麦康凯液体（MACb）培养基（批号：171205）、肠道菌增菌液（EE 增菌液）（批号：180222）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号：180627）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）培养基（批号：170804）等均由北京陆桥技术股份有限公司提供；为了使菌落能更好地生长，本研究选择了TSB 培养基作为稀释液[10]。

1.3 菌种

微生物计数方法适用性试验所用菌种为金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003][9]，控制菌检查方法适用性试验所用菌种为大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门氏菌[CMCC（B）50094]，均由广东环凯微生物科技有限公司提供，试验所用菌株均为第3 代。

1.4 仪器

高压蒸汽灭菌器（MLS-3781L-PC，山东博科生物产业有限公司）、电子天平（HZT-A600，精确度：0.01 g，沈阳龙腾电子有限公司）、生物安全柜（ClassⅡBSC，山东博科再生医学有限公司）、生化培养箱（SPX-150B，上海博泰实验设备有限公司）、电热恒温培养箱（DHP-420，苏州正合测试设备有限公司）、细菌浊度分析仪（GXZ-0101，德国KEWILL）。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

按2015年版《中华人民共和国药典》 四部通则1105、1106[9]要求进行制备。

2.2 供试液制备

取供试品10 g，加TSB 培养基至100 mL，匀浆，制成1∶10 供试液；取上述供试液1 mL 加至9 mL TSB培养基中，制成1∶100 的供试液，依法制成1∶1000 的供试液；取1∶10 供试液2 mL 加至8 mL TSB 培养基中，制成1∶50 供试液。

2.3 需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数

2.3.1 常规法 试验组：取“2.1”项下菌液0.1 mL，加至10 mL 1∶10 供试液中，反复吹洗，混匀；供试品对照组：取供试液，以TSB 培养基代替菌液，其他同试验组；菌液对照组：取TSB 培养基替代供试液，其他与试验组相同。以上每组各取1 mL 注入平皿中，加入15～20 mL 对应的培养基，每个菌液平行制备2个平皿，测定菌液中的菌落数。其中，菌液不超过供试液的1%[11]，下同。2.3.2 增加稀释液法 试验组：取“2.1”项下菌液0.1 mL，加至10 mL 1∶50或1∶100 供试液中，反复吹洗，混匀；供试品对照组：取供试液，以TSB 培养基代替菌液，其他与试验组相同；菌液对照组：制备同2.3.1 项下菌液组制备方法。以上每组各取1 mL 注入平皿中，加入15～20 mL 对应的培养基，每个菌液平行制备2个平皿，测定菌液中的菌落数。

2.4 控制菌检查

2.4.1 耐胆盐革兰氏阴性菌 ①常规法。供试品组：分别取“2.2”项中1∶10、1∶100、1∶1000 供试液各1 mL 加入10 mL EE 增菌液液体培养基中，平行制备3份；其中两份加入≤100 cfu 的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，作为阳性对照组，依相应控制菌检查方法检查；阴性对照组：以稀释液代替供试液，其他同供试品组。②增加培养基体积法。供试品组：分别取2.2 中1∶10、1∶100、1∶1000 供试液各1 mL 加入20 mL或50 mL EE 增菌液液体培养基中，平行制备3份；其中两份加入≤100 cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，作为阳性对照组，依相应控制菌检查方法检查；阴性对照组：以稀释液代替供试液，其他同供试品组。2.4.2 大肠埃希菌 ①常规法。供试品组：取“2.2”项中1∶10 供试液10 mL，接种至100 mL TSB 培养基中，平行制备2份；其中一份加入≤100 cfu 的大肠埃希菌，作为阳性对照组，依相应控制菌检查方法检查；阴性对照组：以稀释液代替供试液，其他同供试品组。②增加培养基体积法。供试品组：取“2.2”项中1∶10 供试液10 mL，接种至200 mL TSB 培养基中，平行制备2份；其中一份加入≤100 cfu 的大肠埃希菌，作为阳性对照组，依相应控制菌检查方法检查；阴性对照组：以稀释液代替供试液，其他同供试品组。2.4.3 沙门菌 ①常规法。供试品组：取供试品10 g，接种至100 mL TSB 培养基中，平行制备2份；其中一份加入≤100 cfu 的乙型副伤寒沙门菌，作为阳性对照组，依相应控制菌检查方法检查；阴性对照组：以稀释液代替供试液，其他同供试品组。②增加培养基体积法。供试品组：取供试品10 g，接种至200 mL TSB 培养基中，平行制备2份；其中一份加入≤100 cfu 的乙型副伤寒沙门菌，作为阳性对照组，依相应控制菌检查方法检查；阴性对照组：以稀释液代替供试液，其他同供试品组。

2.5 结果

2.5.1 企业微生物限度方法适用性试验 方法适用性试验中需氧菌总数3个企业采用常规法，1个企业采用增加稀释液法（1∶50）；霉菌和酵母菌计数4个企业均采用常规法；耐胆盐革兰阴性菌3个企业采用常规法，1个企业采用增加培养基体积法；大肠埃希菌4个企业均采用常规法；沙门菌3个企业采用增加培养基体积法（200 mL），1个企业采用常规法（表1）。2.5.2 微生物限度方法适用性试验结果 4个企业分别采用了常规法、增加稀释液法（1∶50、1∶100）两种稀释级进行了方法适用性试验，每种试验菌回收比值均在0.5～2.0，但是增加稀释液法比常规法回收比值高（表2）。4个企业分别采用了常规法、增加培养基体积法进行方法适用性试验，两种方法均呈阳性结果（表3）。

3 讨论

3.1 试验小结

药品评价标准中微生物限度直接关系药品自身质量，更是关系到患者的用药安全[12]，中成药组分相对复杂，剂型广泛，微生物检测方法的适用性试验就显得更为重要[13-15]。方法适用性试验的本质是建立对样品影响更小、操作率更高的方法[16]，但其本身工作量大，而且存在不同实验室方法欠佳、重复劳动过多的问题[17]，因此同一品种建立统一合理有效的方法适用性试验是重点。

本研究结果显示，4个企业微生物限度方法适用性试验均存在方法差异。针对这一问题，本研究分别对4个企业养阴清肺丸微生物限度方法适用性试验进行验证。本研究结果显示，4个企业需氧菌总数3种方法回收比值均在0.5～2.0；霉菌及酵母菌总数两种方法回收比值均在0.5～2.0，因此，4个企业的养阴清肺丸微生物计数方法适用性试验均可采用常规法。4个企业耐胆盐革兰氏阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌的两种方法均出现阳性结果，因此，4个企业控制菌检查均可采用常规法。

表1 4个企业提供的微生物限度检查方法适用性试验

表2 微生物计数方法适用性试验回收比值

表3 控制菌方法适用性试验结果

3.2 结果分析

目前，药品微生物限度检查是客观衡量药品（主要指中药及含有动植物提取物的品种）质量的一项重要指标[18]，主要涉及到药品原材料及辅料的生产工艺步骤、生产环境等方面。因此，药品微生物限度检验非常重要，但在检验过程中很容易受到各种因素影响从而发生误差，所以，生产企业需重视人员、物品、环节及制度等各方面改善，优化质量标准，针对性加强防范和控制，确保降低误差率[19]。

目前，全国共有48家企业生产养阴清肺丸，55个批准文号，其中成药原药材、功能主治一致，但剂型不同、生产企业不同，生产工艺与辅料会有所差异，最终导致抑菌活性的区别[20]。从表2 可以看出，因原料产地、批次、辅料及生产工艺存在一定差异，不同生产企业同一品种的微生物限度方法适用性试验结果存在差异，尤其是微生物计数回收比值，尽管常规法每种试验菌的回收比值低于培养基稀释法，但均在0.5～2.0，符合试验要求，为方便不同企业检验人员操作，可以统一采用常规法。