沙棘果油脂肪酸与微量元素测定

魏晋梅，刘彩云,2*，方彦，坚乃丹

1(甘肃农业大学，甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州， 730070)2(甘肃省科学院生物研究所，甘肃 兰州， 730000)

沙棘是一种重要的生态和经济作物，胡颓子科沙棘属，生命力顽强，可生长于极寒、极旱的环境中，其果实呈红色、橙色或黄色，富含酚类、黄酮类、有机酸、多糖等生物活性物质和人体所需的各种营养物质，如维生素、不饱和脂肪酸、氨基酸、微量元素等[1-4]，具有抗氧化、延缓衰老、抑制肿瘤细胞生长、止咳祛痰、抗辐射、活血散瘀、防治冠状动脉粥样硬化等作用[5-8]。沙棘果实、叶子提取物和籽油广泛应用于食品、保健、医药和化妆品行业[9]。沙棘油有“液体黄金”之美誉，被我国批准临床使用，并于1977年正式列入药典，俄罗斯宇航员用沙棘油防止有害辐射[10]。沙棘油含有多种人体需要的微量元素，如Na、Ca、K、Mg、Fe、Zn等，无机成分对于沙棘油的营养性、安全性和稳定性均起着极其重要的作用[11]，其进入沙棘油的途径主要是果实对自然环境无机元素的吸收与富集、加工过程中金属的接触及污染等[12]。

目前，文献报道对沙棘的研究多集中于其叶子提取物[13-14]。油脂是生活中不可缺少的食物之一，沙棘油中脂肪酸与微量元素的测定已有文献报道，但对脂肪酸含量的测定仅限于百分比含量[15-17]，目前，尚未见文献报道其绝对含量。本文基于气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)测定沙棘果油中脂肪酸组成，应用内标方法计算各成分的含量；采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES)测定微量元素，旨在建立沙棘果油脂肪酸和微量元素的准确测定方法，为沙棘的进一步开发利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

沙棘果购自宁夏回族自治区吴中市，经亚临界流体萃取而得沙棘果油。

1.2 仪器与试剂

CBE-20L亚临界双溶剂萃取实验室成套设备，河南省亚临界生物技术有限公司；Agilent 7890B-7000GC/TQ GC-MS，美国Agilent公司；IRIS IntrepidⅡ XSP电感耦合等离子体发射光谱仪，泵管类型为Tygon-Orange，美国Thermo公司；ETHOS UP微波消解萃取系统，VB24 UP电子控温赶酸器，美国Lab Tech公司；RE-52C 旋转蒸发仪，郑州市亚荣仪器有限公司；超纯水处理系统，美国Millipore公司；氩气、氦气(纯度：99.999%)；37 种脂肪酸甲酯混合标准对照品与十一烷酸(99.98%)，购自美国 SUPELCO 公司；K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn标准溶液(质量浓度均为100 μg/mL)，中国计量科学研究院；正己烷(色谱纯)、HNO3、高氯酸、HCl(优级纯),德国Merck公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 沙棘油制备

亚临界流体萃取沙棘果油工艺：

沙棘干燥→粉碎→过筛→装料→抽真空→加入溶剂→萃取→脱溶→回收样品

萃取工艺参数：提取溶剂为正丁烷，料液比为1∶3，萃取温度45 ℃，萃取时间30 min，萃取次数3次。参照文献方法[18-19]计算亚临界流体萃取沙棘果油的萃取率,如公式(1)所示：

(1)

1.3.2 标准溶液配制

准确称取2.5 g十一烷酸(精确到0.01 g)，甲醇溶解，定容至500 mL容量瓶中，制成质量浓度为5 mg/mL内标储备液。取2.5 mL标准储备液，甲醇稀释，定容至100 mL容量瓶中，制成质量浓度为0.125 mg/mL的内标工作液。

分别取K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn单元素标准溶液，加入空白样品溶液，配制成系列标准工作液，K的质量浓度为0.25、0.5、2、10、20 μg/mL，Na为1、2、5、10、20 μg/mL，Cu为0.005、0.1、5、10、50 μg/mL，Zn为0.5、0.1、2、10、50 μg/mL，Ca为0.5、1、5、10、50 μg/mL、Mg为0.25、1、5、10、50 μg/mL，Fe为0.1、0.5、2、5、10 μg/mL、Mn为0.005、0.05、1、5、10 μg/mL。

1.3.3 脂肪酸甲酯制备

参照中华人民共和国国家标准GB 5009.168—2016方法[20]，并稍作修改。称取试样1.0 g(精确到0.01 g)于50 mL烧瓶中，加入5 mL内标工作液、8 mL 2% 氢氧化钠-甲醇溶液与5 mL 14% 三氟化硼-甲醇溶液，(80±1) ℃水浴回流60 min，取下烧瓶，迅速冷却至室温，转移样品至离心管，用3 mL正己烷洗涤烧瓶2次，合并溶液于离心管中，旋涡振荡，充分混匀后5 000 r/min离心5 min，取上清液，用0.22 μm有机相过滤膜过滤，进GC-MS测定。

1.3.4 微量元素提取

参照袁建民等[21]方法，并稍做修改。准确称取0.3 g(精确到0.01 g)沙棘果油于聚四氟乙烯消解罐内，加入8 mL优级纯HNO3，放置5～10 min，使样品与试剂充分混合。微波消解程序：初始温度室温，0～15 min升至140 ℃，保持5 min，20～35 min升至190 ℃，保持20 min，55～90 min降至室温，赶酸后，加入2%(体积分数)优级纯HNO3定容至25 mL，进ICP-AES测定。

1.3.5 空白溶液制备

不加试样，按照1.3.3步骤获得空白样品溶液。

1.3.6 仪器工作条件

GC-MS工作条件参照魏晋梅等[22]方法；ICP-AES工作条件 RF发生器功率1 150 W；冲洗泵速120 r/min，2.22 mL/min；分析泵速120 r/min，2.22 mL/min，泵缓冲时间为5 s；辅助器流量0.5 L/min，雾化器压力28.0 psi。

1.3.7 定性与定量方法

脂肪酸甲酯经Agilent Masshunter数据处理系统检索，并与标准品比对进行鉴定，内标法定量。微量元素采用外标法定量。

脂肪酸含量计算如公式(2)所示：

(2)

式中:Xi为试样中脂肪酸i的含量(mg/g)；CSi、ASi、C11和A11分别为37种脂肪酸甲酯混和标准中脂肪酸甲酯i的质量浓度(mg/L)、峰面积与十一烷酸甲酯浓度(mg/L)、峰面积；Ai、AC11、CC11和VC11分别为试样中脂肪酸甲酯i的峰面积与内标峰面积、质量浓度(mg/mL)、体积(mL)；m为试样质量(g)。

2 结果与分析

2.1 沙棘果油脂肪酸组成与含量

沙棘果油GC-MS色谱图见图1，检测到的脂肪酸种类和含量如表1所示，19种脂肪酸中饱和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)含量为24.42%，其中C16∶0含量较高(39.71 mg/g)，占92.03%；单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)含量为47.26%，含量较高的为C16∶1和C18∶1，分别为44.29和48.15 mg/g，共占99.75%；多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)含量为28.31%，C18∶2、C18∶3含量较高，均为35.25 mg/g，不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acids，USFA)含量是SFA的 3.1倍。结果表明，沙棘果油中含有丰富的棕榈油酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，此结果与文献报道结果相近。岳虹等[16]在沙棘油中检测到16种脂肪酸，USFA含量是SFA的4倍(分别为80.09%和19.91%)；张素敏等[23]检测到沙棘油中有13种脂肪酸，USFA/SFA=2.7(分别69.37%为和26.01%)，青海沙棘果油中USFA/SFA=2.1(分别为66.92%和32.54%)[17]。由表1可知，沙棘果油中n-6与n-3不饱和脂肪酸比率接近1，此结果与文献[6]报道结果相近。

图1 沙棘果油脂肪酸甲酯GC-MS总离子流图

表1 沙棘果油中脂肪酸种类和含量

2.2 溶解酸与用量的选择

处理样品时，酸的加入是对ICP-AES测定产生化学干扰的主要因素。不同的酸，由于比重、黏度等物理性质各不相同，它们进入ICP炬焰后，蒸发速率不一致，从而在分析过程中带来化学干扰。根据酸效应的干扰顺序HCl

表2 酸对样品处理的影响

2.3 分析谱线的选择

测定中发现各元素都有不同的光谱干扰，根据谱线与级次选取的原则(分析微量元素时，要采用灵敏线)，本实验选择的各元素分析线为：K 766.491 nm，Na 588.995 nm，Cu 324.754 nm，Zn 213.856 nm，Ca 393.366 nm，Mg 279.553 nm，Fe 259.940 nm，Mn 257.610 nm。

2.4 标准曲线

基体匹配是减少、消除基体干扰的有效方法，本实验系列标准工作溶液用空白样品溶液稀释配制，并在选定的仪器条件下测定，根据浓度与响应值的关系，仪器自动绘制出标准曲线，得到线性回归方程和相关系数(表3)，8种元素的相关系数r2为0.999 3～1.000。根据标准工作曲线，求出实际样品含量值，将得到更准确的测定结果。

表3 8种元素工作曲线

2.5 加标回收与精密度实验

在已知各元素含量的沙棘油中添加高、中、低3个浓度的标准工作溶液1 mL，每个浓度添加6个样品，按1.4.2方法进行回收率实验，结果见表4。各元素的平均回收率为85.0%～94.4%，相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为3.28%～9.23%(RSD<10%)，因此本实验方法可行，测定结果准确可靠。

表4 方法回收率与精密度实验

2.6 检出限

参照吕小园等方法[27]，并稍作修改。按分析方法进行15次空白实验，以10倍的标准偏差除以标准工作曲线的斜率，计算各元素的检出限。K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的检出限分别为0.006、0.003、0.001 5、0.001 2、0.001 2、0.001 2、0.002 5和0.005 μg/mL。按照称样0.3 g定容至25 mL，本实验方法样品中K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的检出限分别为0.5、0.25、0.125、0.1、0.1、0.1、0.2和0.4 μg/g。

2.7 微量元素测定

运用建立的分析方法测定沙棘油中8种微量元素的含量，重复3次，求平均值，得到样品中各元素的浓度，计算含量，结果见表5。Na、Ca、K、Mg、Fe、Zn含量较高，与张荣[28]结果相近。本实验研究结果与文献报道结果有一定差异，董亚蕾等[11]报道沙棘果汁中含量较高的微量元素依次为 K、Na、Ca、Mg，Fe元素含量范围是1.8～2.8 mg/L，TSERING等[29]测定了跨喜马拉雅山的莱赫山谷的沙棘果实中微量元素，K、Ca、Na含量较高，分别为647.2、176.6、414.2 mg/L，Fe和Mg分别为30.9、22.5 mg/L，Zn、Cu、Mn含量较低，分别为1.4、0.7和1.06 mg/L，原因可能是沙棘品种和生长地域环境条件影响了植物对微量元素的吸收与富集。HU等[30]认为Ca在沙棘中的含量为叶>籽>果，说明植物不同部位对微量元素的吸收与富集能力不同。

表5 沙棘油中8中微量元素含量

3 结论

采用内标方法定量了沙棘果油中19种脂肪酸。C16∶0、C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3含量较高，分别为39.71、44.29、48.15、35.25和35.25 mg/g，USFA含量是SFA的3.1倍。沙棘果油中含有丰富的油酸、亚油酸和亚麻酸。K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的检出限分别为0.5、0.25、0.125、0.1、0.1、0.1、0.2和0.4 μg/g，各元素的平均回收率为85.0%～94.4%，相对标准偏差为3.28%～9.23%(RSD<10%)。沙棘果油中含有丰富的Na(149.28 μg/g)、Ca(65.29 μg/g)、K(41.08 μg/g)、Mg(21.27 μg/g)、Fe(14.43 μg/g)、Zn(4.71 μg/g)等微量元素。沙棘果油中含有丰富的不饱和脂肪酸与人体所需微量元素，具有很高的营养价值，该研究结果为沙棘的进一步开发利用提供了基础数据。