赣北工夫红茶滋味特征及关键化合物分析

岳翠男，秦丹丹，蔡海兰，王治会，李琛，李延升，杨普香*

1(江西省蚕桑茶叶研究所，江西 南昌, 330202) 2(江西省茶叶质量与安全控制重点实验室，江西 南昌, 330202)3(广东省农业科学院茶叶研究所，广东 广州, 510640)

滋味是茶叶的重要感官属性，影响茶叶滋味的化学组分多且存在复杂的交互影响[1-2]。食品风味术语是对产品感官性质的表达，其形成是通过经过训练的评价组对代表性样品的评价、讨论而建立起来，能够描述产品的风味特征、区别不同风味的产品[3-5]。赣北工夫红茶包括宁红和浮梁红茶，以特殊的“苹果香”和甜醇的滋味著称，是中国最早的工夫红茶之一，深受市场和消费者的青睐。当前，关于赣北工夫红茶滋味表征和其滋味贡献成分尚未见报道，因此，研究其分子感官基础具有重要意义。

非靶向代谢组学研究对象是生物样品中所有的内源性代谢物，采用理想的非靶向代谢组学样品采集手段和制备方法可以尽可能多的提取出样品的代谢物，且简便快速[6-7]。近年来，越来越多的科学工作者将其应用到茶学研究领域，获得有效的茶树次生代谢规律以及不同茶类之间的差异代谢产物，便于人们了解茶叶内源性信息[8-10]。因此采用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)的非靶向代谢组学可以有效地检测出茶叶中可以被人们感受到的滋味化学物质。定量描述分析(quantitative description analysis，QDA)是一种具备剖析、描述、定量功能的风味检验方法，其可以用简单、大众的词汇描述样品的感官印象，可单独或综合的应用于样品的外观、香气、滋味与口感特征的评价[11-12]。前人采用QDA法构建了绿茶滋味、绿茶香气、红茶香气、乌龙茶风味、滇红风味的描述词并对其强度进行评价，获得相关茶类的风味特征，提高人们对茶叶品质的感官认知度[11，13]。

本研究以赣北工夫红茶为研究对象，采用LC-MS和QDA分析样品的非挥发性化合物以及滋味特征。拟对样品滋味进行感官评价，鉴定其滋味化合物的构成，以非挥发性化合物含量为自变量，滋味感官分属性强度为因变量，采用偏最小二乘-重要变量投影(partial least square-variable import project，PLS-VIP)进行统计分析，筛选出对滋味感官分属性有重要贡献的投影变量。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料来自赣北不同厂家和不同等级的11份工夫红茶样品。其中编号1～8为宁红，采购于修水县，编号9～11为浮梁红茶，采购于浮梁县，样品的加工采用传统的工夫红茶加工方法，包括鲜叶采摘、萎凋、揉捻、发酵、干燥、提香。每个样品包装采用统一规格的茶叶专用铝箔袋，统一放在-4 ℃冰箱。

1.2 实验方法

1.2.1 样品非挥发性化合物检测

实验样品处理：(1)称取50 mg粉碎后的样品于5 mL离心管，加入0.1 mg/mL的L-2-氯苯丙氨酸，0.1 mg/mL的Lyso PC17∶0，0.1 mg/mL的Cholesterol-3,4-13C2，0.1 mg/mL的Glycocholic acid-13C1各20 μL作为内标；(2)继续向离心管中加入1 mL体积分数70%的甲醇水溶液，密封超声提取30 min，-20 ℃静置20 min，在13 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min；(3)将上清液转入新的5 mL离心管中；重复操作步骤(2)2次，每一次获得的提取液均移入(3)中的离心管，定容；(4)将获得的提取液旋涡30 s，用注射器吸取200 μL的上清液，使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶进行LC-MS分析，每个样品3次重复。

液相色谱-质谱分析条件：采用Waters ACQUITY UPLC I-Class/VION IMS Qtof MS高分辨质谱仪组成的液质联用系统。色谱柱为：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱温45 ℃；流动相A：0.1%(体积分数)甲酸，流动相B：V(乙晴)∶V(甲醇)=2∶3(含0.1%甲酸)；流速0.4 mL/min；进样量1 μL。流动相A的洗脱梯度为：0 min～1 min，99%～70%；1 min～2.5 min，70%～40%；2.5 min～6.5 min，40%～10%；6.5 min～8.5 min，10%～0%；8.5 min～10.7 min，0%～0%；10.7 min～10.8 min，0%～99%；10.8 min～13 min，99%～99%。质谱条件：离子源ESI；样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式。毛细管电压2.5 kV；进样电压40 V；碰撞电压6 eV；离子源温度115 ℃，脱溶剂温度450 ℃，脱溶剂气流速900 L/h，质谱扫描范围50～1 000 amu；扫描时间0.2 s；扫描间延迟0.02 s。

LC-MS定性：原始数据经代谢组学处理软件Progenesis QI V2.3软件进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化。化合物的鉴定基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布，使用The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(V2.3)以及METLIN数据库进行定性。LC-MS定量：采用峰面积归一法。

1.2.2 茶样感官评价

评价员筛选与描述词产生：依据Herbert Stone建立的QDA理论体系，参与感官评价的人员必须具备一致、敏感、客观及可控性[14-16]。因此，采用一般味觉筛选的三角试验以及顺位试验进行评价员筛选，最终筛选出能分辨80%以上滋味的6名评茶员组成评价小组。称取3.0 g干茶放入评茶杯中，注入150 mL沸水，5 min后沥出茶汤，由建立的评价小组对样品的滋味剖面进行初步描述，产生初步描绘词。之后进行讨论，再结合已有文献所报道的工夫红茶的风味描述词和江西红茶传统风味特描述词，删除描述不清的和重复的词汇，最终建立的描绘词及定义见表1。

茶样滋味感官评价：茶汤制备与上述相同，由评价小组按照建立的滋味描述词及参比物进行评价，滋味描绘词的感觉强度尺度为1～15，1～3为极微弱；3～5为微弱；5～7为弱；7～9为一般；9～11为较强；11～13为强；13～15为极强。结果取均值。

表1 赣北工夫红茶滋味描述词

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 20.0进行描述统计、方差分析和相关分析；采用SIMCA14.1进行偏最小二-乘重要变量投影分析。

2 结果与分析

2.1 赣北工夫红茶的滋味感官定量描述分析

2.1.1 样品滋味分属性强度的方差分析

样品的9种滋味分属性的强度评价结果见表2。从样品各滋味分属性平均值及方差分析可以看出赣北工夫红茶的感官特征以甜、醇和回甘为主，各样品的感官分属性之间均有统计学差异。苦、涩、酸、甜、鲜是人类的基本味觉属性，厚、醇、回甘等滋味分属性是茶汤在口腔中的质构表征和味感持续效应[17]。QDA分析发现，茶汤的苦味、涩味、酸味及鲜味强度在“一般”及以下水平；样品的甜味强度整体较高，只有11号样的甜味和其他样品间均存在显著差异(P<0.05)；“厚”是茶汤内含物质在口腔中的综合反映，茶汤厚度高，说明内含成分丰富[14]，本研究所选择样品的厚度存在显著性差异(P<0.05)，推测原因是样品之间的滋味成分差异性较大；“醇”是衡量茶汤滋味品质的重要指标，醇味强度的高低一定程度上可以反映消费者的喜好度，样品的醇味强度为6.5～10.5，部分样品间具有统计学差异，但整体较高，从侧面说明了宁红和浮梁红茶市场接受性高的原因；异味产生多因加工工艺不当、加工环境不够洁净、贮存不当等，本研究所抽取样品的异味均在极微弱水平。

表2 赣北工夫红茶滋味感官定量描述分析结果

2.1.2 样品滋味分属性强度的相关性分析

采用相关性分析法探究茶汤滋味分属性之间的相关性，结果见表3。赣北工夫红茶的整体滋味强度与异味、苦味分别呈极显著、显著负相关，与酸味、涩味呈负相关，但未达到显著水平；其与甜味和醇味分别呈极显著和显著正相关，回甘、鲜味、厚味也与茶汤的整体滋味品质呈正相关，但未达到显著水平。滋味分属性之间也存在显著相关性，茶汤的苦味和涩味呈显著正相关，与甜味呈显著负相关，有研究表明涩味和苦味两者之间具有明显的加和效应[15]；甜味与异味之间具有极显著负相关；鲜味与回甘之间具有极显著正相关，这两者均与整体滋味强度呈正相关。

表3 各滋味分属性的相关性分析

2.2 赣北工夫红茶的非挥发性成分分析

对赣北工夫红茶样品进行LC-MS检测分析，其分析结果见图1，红色代表化合物在茶样中含量高于平均值，绿色代表化合物在茶样中含量低于平均值，颜色深浅代表含量高低程度。主要检测到的共有非挥发性化合物74种，包括25种酚类、23种氨基酸类、9种色素类、9种有机酸类、5种糖类、2种生物碱和茶皂素，酚类包括儿茶素类、黄酮醇类和黄酮苷类，氨基酸为不同类型的氨基酸单体和复合氨基酸，色素类分为茶黄素类、花色素类和花青素类；糖类包括单糖、二糖和三糖；生物碱包括咖啡碱和可可碱。从热图颜色深浅上可以看出，每一种化合物在11份工夫红茶中含量均有差异，未发现颜色完全一致的成分，此结果也从侧面说明了茶样各感官分属性均有统计学差异的原因。

图1 主要非挥发性成分热图分析

2.3 赣北工夫红茶滋味特征关键贡献化合物筛选

PLS-VIP可以对庞大的数据系统进行分解和降维，从复杂的数据变量中识别出对因变量影响较大的自变量，且可以有效地避免自变量之间多重共线性的干扰[17-18]。以非挥发性化合物为自变量X，滋味感官分属性为因变量Y，进行PLS-VIP分析。样品在前2个主成分上的分布结果见图2。

图2 样品在主成分上的分布

PLS提取出3个主成分，对模型的总解释度为72.1%，11个样品中7、8号样品以及4、6号样品存在重叠，原因7、8号和4、6号样品源于同一生产厂家，所使用茶树品种以及鲜叶等级一致，其他各样品可以在主成分上有效的区分开来，说明模型的可信度较高，可以进行下一步的PLS分析。滋味分属性与主要非挥发性成分的关联图见图3。

图3中的非挥发性成分对滋味分属性的VIP值>1时，即说明其为赣北工夫红茶滋味的关键贡献成分，其中共有33种化合物的VIP值>1，包括10种氨基酸类、12种酚类、3种色素类、1种生物碱、4种酸类、3种糖类。分别是L-组氨酸、富马酸、咖啡碱、L-天冬酰胺、异麦芽糖、L-精氨酸、山奈酚、槲皮素、茶黄素酸、D-木糖、D-葡萄糖、甲基半胱氨酸、奎宁酸、紫云英苷、L-酪氨酸、L-谷氨酸、胱氨酸、莽草酸、茶黄素 3-没食子酸酯、表儿茶素(epicathchin，EC)、飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷、L-天门冬氨酸、儿茶素没食子酸(catechin gallate，CG)、没食子儿茶素没食子酸(gallocatechin gallate，GCG)、山奈素3-O-鼠李糖苷、没食子儿茶素(gllocatechin，GC)、杨梅素、没食子酸(gallic acid，GA)、柠檬酸、茶黄素、L-焦谷氨酸、L-苏氨酸和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)。说明此33种非挥发性成分为赣北工夫红茶滋味的关键贡献成分。

2.4 各滋味分属性关键贡献化合物筛选

为进一步探讨每个滋味分属性的关键贡献成分，以各滋味分属性强度为因变量Y和主要非挥发性化合物为自变量X进行PLS-VIP分析，得到对8个滋味分属性具有重要贡献的化合物，因异味PLS解释度较差，对异味具有重要贡献的物质需进一步结合香气成分进行讨论，VIP值>1的成分筛选结果见表4。

苦味-VIP：对苦味有重要贡献的化合物有14种，包括2种氨基酸类、3种多酚类、4种色素类、2种生物碱、2种酸类、1种糖类和茶皂素；对苦味影响最大的为咖啡碱，其次为可可碱，两者的的VIP值分别为4.17和3.59，远高于其他化合物的VIP值，从呈味特性来看，咖啡碱和可可碱均为苦味，相关研究已表明，咖啡碱与苦味有显著的正相关[19]；4种色素类化合物主要是茶黄素类，其可以和咖啡碱络合从而改善茶汤的风味[15]，3种酚类物质均属于黄酮苷类化合物，通常在口腔里表现为涩味，可以加强味觉和大脑对苦味的感知，继而增强茶汤的苦味；茶皂素具有辛辣的苦味，会抑制茶汤的甜味[20]。

涩味-VIP：对涩味有重要贡献的化合物有27种，包括10种氨基酸、9种酚类、5种酸类、1种生物碱类、1种色素类、1种糖类。对涩味影响较大的化合物为具有涩味的酚类和苦味氨基酸类化合物，以及呈酸味的草酸和呈苦味的L-异亮氨酸、L-酪氨酸；多酚类中EGCG阈值较低，属于含量最高的儿茶素，被认为是对绿茶涩味贡献最大的儿茶素[15]，而在涩味PLS-VIP分析中，EGCG的贡献不大，可能是由于赣北工夫红茶中的EGCG氧化较为充分。

鲜味-VIP：鲜味具有味觉平衡风味增强作用[21]。影响茶汤鲜味的关键化合物有27种，包括10种酚类、7种氨基酸类、4种色素类、2种酸类、2种生物碱、2种糖类，对鲜味影响较大化合物为L-谷氨酸、L-精氨酸、异麦芽糖、和紫云英苷，本研究中工夫红茶的鲜味处于“弱”强度水平，推测可能是由于L-谷氨酸的滋味被呈涩味的酚类化合物削弱而引起的；投影到鲜味的化合物种类较多为呈涩味的多酚类物质，口腔中涩味的存在对鲜味具有抑制效应。

酸味-VIP：对酸味有关键影响的滋味化合物有33种，包括8种氨基酸类、11种酚类、5种色素类、7种酸类、2种糖类，对酸味影响较大的是天冬酰胺、芹菜素和莽草酸等。7种酸类对酸味的VIP值为1.01～1.50，对酸味有贡献的化合物呈味特性主要为酸味、甜味和涩味，说明这几种滋味之间可能存在交互效应，相关性分析结果也显示涩味、苦味与酸味之间呈正相关，甜味、鲜味与酸味呈负相关。样品的酸味整体强度较低，可能是由于赣北工夫红茶的甜味强度高，抑制了酸味在味蕾上的表达。

甜味-VIP：甜味是赣北工夫红茶优异品质的重要表现。影响茶汤甜味的化合物主有19种，包括8种氨基酸类、6种酚类、3种糖类、1种酸类、1种色素类，对甜味影响较大的为D-葡萄糖、山奈素-3-O-鼠李糖苷和山奈酚等，后两者属于黄酮苷类，而该类物质多表现为涩味，且在高浓度条件下，还可以增强茶汤的苦味[22-23]，因此，在茶叶加工过程中应减少黄酮苷类化合物的积累，还需通过一定工艺处理，促进多糖类和糖苷化合物水解为单糖、二糖等可溶性糖类化合物，提高茶汤的甜度。

回甘-VIP：回甘是多种滋味分属性的综合效应[15]。对回甘有关键影响的化合物有30种，包括6种氨基酸类、13种多酚类、4种色素类、4种酸类、2种糖类、1种生物碱，其中异麦芽糖、原花青素、紫云英苷影响较大，有研究表明，涩感是回甘的关键贡献分属性之一，前面相关性分析结果表明，回甘与苦味、涩味以及酸味呈负相关，与鲜味、甜味呈显著的正相关，表明具有甜味和鲜味的化合物对回甘有正效应，呈苦味、涩味、酸味的化合物对回甘有负效应，然而，在PLS-VIP结果中，VIP值>1多为呈涩味、苦味和酸味的化合物，呈甜味或鲜味的化合物只有L-组氨酸、异麦芽糖和D-葡萄糖，从侧面说明了样品的整体回甘强度较弱的原因。

醇味-VIP：醇味是滋味化合物之间互作效应协调的表现[17]。对醇味有重要影响的化合物有20种，包括8种氨基酸类、茶皂素、3种酚类、1种色素、1种生物碱、5种酸类、1种糖类，其中贡献较大的为L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸，VIP>1的化合物以呈鲜味、甜味、酸味为主，从化合物种类来看，糖类化合物对醇味的影响较小。

厚味-VIP：对厚味有重要贡献的化合物有34种，包括16种氨基酸、7种酚类、3种色素、5种酸类、2种糖类和茶皂素，贡献较大的为草酸、谷氨酰胺、L-苹果酸，此3种化合物均带有酸味，且所检测到的酸类化合物中，有50%以上与厚味密切相关，因此，推测酸类化合物对“厚”的影响极大，然而，在滋味分属性相关性分析中，酸味与厚味之间并没有明显的相关性，目前，本研究未能对这2种相悖的结论做出有价值的解释，需要进一步的研究。

3 结论

获得了赣北工夫红茶的9个滋味描绘词及定义，其滋味特征以甜味、醇味和回甘为主，各样品的滋味分属性之间存在统计学差异，且滋味分属性之间存在复杂的相关性。共筛选到74种共有非挥发性化合物，包括25种酚类、23种氨基酸类、9种色素类、9种有机酸类、5种糖类、2种生物碱和茶皂素；其中有33种化合物对赣北工夫红茶滋味具有重要贡献，分别为L-组氨酸、富马酸、咖啡碱、L-天冬酰胺、异麦芽糖、L-精氨酸、山奈酚、槲皮素、茶黄素酸、D-木糖、D-葡萄糖、甲基半胱氨酸、奎宁酸、紫云英苷、L-酪氨酸、L-谷氨酸、胱氨酸、莽草酸、茶黄素-3′-没食子酸酯、EC、飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷、L-天门冬氨酸、CG、GCG、山奈素3-O-鼠李糖苷、GC、杨梅素、GA、柠檬酸、茶黄素、L-焦谷氨酸、L-苏氨酸和EGCG，并进一步得到了对各滋味分属性具有重要贡献的化合物。