超声波提取福建佛手皮渣多糖及抗氧化分析

黄 靖，陈 婵

(福建农业职业技术学院，福建 福州 350007)

福建为我国佛手主产地之一，福建佛手称“建佛手”或“闽佛手”，在福建泉州、宁德、莆田等地均有种植[1]。佛手(CitrusmedicaL var.sarcodactylis)为芸香科柑橘属植物，其药性温，味辛、苦、酸，归肝、脾、肺经。近年来，随着佛手饮料[2]、佛手酥[3]、佛手发酵酒[4]等初加工食品的开发，产生了大量未被利用的皮渣，造成了资源的浪费[5]。研究表明，佛手皮渣中含有多糖、果胶、黄酮、精油等多种生理活性物质，皮渣中果胶的提取已有系列报道[6-7]，其他活性成分的提取则未见报道。

章斌等[8]研究了复合酶法提取广佛手多糖的工艺研究，其多糖的得率为4.13%。纪跃芝等[9]研究了传统方法提取佛手多糖的最佳工艺设计，多糖得率最高可达7.21%。佛手多糖具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等保健功能，开展佛手多糖的提取研究对我国佛手资源的综合利用具有重大意义[5]。目前，对浙江的“金佛手”与广东、广西的“广佛手”研究较多[10-12]，而对福建“建佛手”的研究较少，超声波提取技术广泛应用于多糖的提取工艺中，其产生的空化和击碎效应等能有效提高细胞破碎效率，并加速多糖成分的扩散释放并溶于溶剂中，提高多糖提取率，但超声波强烈的机械振动可能会造成多糖结构的破坏，进而影响多糖的生理活性[13-14]。

本文采用低频超声功率，以福建佛手皮渣为原料，研究超声波提取法提取佛手多糖的最优工艺，并对提取得到的佛手多糖进行抗氧化研究，为福建本地佛手资源的高值化利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试剂

供试材料：佛手，由福建泉州向阳贤芳佛手农业科技开发有限公司提供。

葡萄糖、无水乙醇、蒽酮、硫酸、甲醇、正丁醇、盐酸、硫酸铁铵、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、三氯乙酸、2-脱氧D核糖、硫代巴比妥酸等均为分析纯。

蒽酮硫酸溶液：准确称取蒽酮0.1 g，加浓度为80%硫酸溶液100 mL使其溶解，摇匀(现用现配)。

1.2 仪器与设备

PB 80 Easy 218美的破壁机，由广东美的生活电器制造有限公司生产；101-2型鼓风干燥箱，由上海浦东荣丰科学仪器有限公司生产；KQ-300 VDV三频数控超声波清洗机，由昆山超声仪器有限公司生产；TDL-5低速台式大容量离心机，由上海安亭科学仪器厂生产；722 s可见分光光度计，由上海精密科学仪器有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 多糖的测定方法 采用蒽酮硫酸法[15]测定多糖。

标准曲线制作：精密吸取0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL具塞试管中，补充蒸馏水至2.0 mL，加入硫酸蒽酮溶液6 mL，置沸水浴中加热15 min，取出后放入水浴中冷却15 min，每个浓度做3次重复，在625 nm波长下迅速测定其吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，所测定的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。在0～0.12 mg/mL的线性范围内，线性方程：y=0.0736x-0.0032，R2=0.9996。

样品测定：将提取的样品液稀释至一定浓度，吸取1.0 mL按上述步骤操作，测定其吸光度，以标准曲线计算多糖含量。

1.3.2 建佛手粗多糖的超声波提取工艺 佛手多糖超声波提取工艺[10,16]：佛手皮渣→烘干至恒重→粉碎→过筛(40目)→脱脂(8倍95%乙醇浸泡过夜)→50 ℃烘干备用→浸泡佛手皮渣干粉30 min(50 ℃蒸馏水)→超声提取(频率为45 KHz)→提取液离心20 min(4000 r/min)→上清液定容→测定吸光值。

根据标准曲线计算佛手多糖得率。计算公式如下：

式中：C表示经过稀释后测定的多糖含量(μg)；V1表示提取后得到的上清液体积(mL);N表示稀释倍数；V2表示用于测定的上清液体积(mL)；m表示用于提取的建佛手质量(g)。

1.3.3 工艺优化试验说明 参考文献[7,17]，单因素试验设计以建佛手皮渣干粉为试样，多糖得率为考察指标，分别考察料液比、超声提取时间、超声提取温度、超声功率4个因素对佛手多糖得率的影响。

本文均采用超声频率为45 KHz，固定超声功率50 W，提取温度为50 ℃，提取时间为60 min，料液比(m/v)为1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100；固定料液比为1∶80，提取温度为50 ℃，超声功率为50 W，提取时间为20、40、60、80、100 min；固定超声时间为60 min，超声功率为50 W，料液比为1∶80，提取温度为50、60、70、80 ℃；固定料液比为1∶80，提取温度为70 ℃，提取时间为60 min，超声功率为40、50、60、70、80 W。根据单因素试验最终结果选定4因素3水平进行正交试验，确定超声波提取的最佳工艺参数。根据正交试验得出的最佳提取工艺，进行5次平行试验进行验证。

1.3.4 建佛手粗多糖的抗氧化研究 比较同浓度下建佛手粗多糖与VC对羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(·O2-)的清除能力。清除·OH能力采用Fenton反应法[18]，清除·O2-能力的测定采用邻苯三酚自氧化法[19]。

1.3.5 数据分析 单因素及正交试验均平行3次，应用DPS数据处理系统进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 料液比对建佛手果渣粗多糖提取率的影响

准确称取定量的建佛手干粉，在超声功率为50 W，提取温度为50 ℃条件下，分别选用1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100料液比提取60 min，考察料液比对粗多糖提取率的影响。结果显示：料液比影响建佛手粗多糖的提取率。在料液比为1∶20～1∶80范围内，佛手多糖得率呈上升趋势，当料液比为1∶80时，建佛手多糖的提取率最高，达到3.09%，随后略有下降。料液比的增加能有效促进水溶性多糖物质的溶出，但当提取溶剂用量过大时会造成多糖浓度过低，影响后续的浓缩、沉淀等操作步骤，造成部分多糖损失(图1)。

图1 料液比对建佛手多糖提取率的影响

2.2 超声时间对建佛手粗多糖提取率的影响

一定量建佛手干粉在料液比为1∶80，超声功率50 W，提取温度为50 ℃时分别提取20、40、60、80、100 min，考察超声提取时间对建佛手粗多糖提取率的影响。结果表明：在超声频率为45 KHz，超声功率为50 W，超声提取温度为50 ℃，料液比为1∶80的提取条件下，超声时间在20～80 min范围内，提取时间越长，建佛手多糖提取率越高，提取时间为80 min时，建佛手多糖的提取率最高，随后下降。原因可能是当超声时间过长时，容易造成多糖的降解，从而使多糖提取率下降(图2)。

图2 超声时间对佛手多糖提取率的影响

2.3 超声提取温度对建佛手粗多糖提取率的影响

其他提取条件不变，将提取温度设置为50、60、70、80 ℃时提取60 min，考察超声提取温度对建佛手粗多糖提取率的影响。结果表明：在超声过程中，温度会有小幅波动，本试验采用的超声频率为45 KHz，在超声提取过程中温度的波动幅度在±3 ℃。本次试验所用的超声设备在温度超过80 ℃时，会自动断电进行自我保护，因此，提取温度为80 ℃时，提取率会受一定影响。在本研究过程中，其他条件不变时，超声提取温度在70 ℃时提取率最高，为3.102%(图3)。

图3 超声温度对佛手多糖提取率的影响

2.4 超声功率对建佛手粗多糖提取率的影响

在料液比为1∶80，提取温度为70 ℃的条件下，选用超声功率为40、50、60、70、80 W提取60 min，考察超声功率对建佛手粗多糖提取率的影响。结果表明：超声功率对建佛手多糖的提取率有影响，建佛手多糖的提取率随着超声功率的提高而增加，在超声功率为60 W时，建佛手粗多糖的提取率最高，达到2.97%，当超声功率大于60 W后，提取率反而下降(图4)。

图4 超声功率对佛手多糖提取率的影响

2.5 正交试验结果分析

根据单因素试验结果，得出因素水平(表1)。以建佛手干粉为试样，以粗多糖提取率为考察对象，选择超声提取时间、超声功率、超声提取温度、料液比4种因素，进行L9(34)正交试验，研究超声波提取佛手粗多糖的最佳工艺条件。

表1 L9(34)正交试验设计

由表2和表3可知，在影响建佛手多糖的超声波提取工艺中，影响因素为A(提取时间)>C(提取温度)>B(超声功率)>D(料液比)。提取时间对佛手多糖的提取率影响极显著(P<0.01)，超声温度与超声功率的影响显著(P<0.05)，料液比的影响无明显显著性。根据正交试验结果，超声波提取建佛手粗多糖最佳提取工艺条件为A1B1C2D2，即料液比1∶60、超声功率50 W、提取温度60 ℃的条件下提取40 min，提取率最高。经过5次验证试验，在此条件下，佛手多糖的提取率最高可达3.32%。验证试验结果与正交试验结果一致。表明超声波提取法提取建佛手多糖，工艺可行稳定，且省时高效，试验结果相对标准偏差小，数据准确。

表2 佛手多糖超声波提取的正交试验结果

表3 试验结果方差分析

2.6 建佛手粗多糖抗氧化活性分析

配制0.2～1.4 mg质量浓度的建佛手多糖提取液，以同浓度的VC溶液为对照组。用Fenton反应法及邻苯三酚自氧化法测定其对·OH及对·O2-的清除作用，结果见图5和图6。建佛手多糖溶液有较好的抗氧化活性，在浓度为0.2～1.4 mg/mL时，其清除能力与浓度呈正比，建佛手多糖溶液对·OH具有较好清除能力，清除作用略低于同浓度的VC溶液，其对·O2-的清除作用低于同浓度的VC溶液。当建佛手多糖质量浓度为1.4 mg/mL时,佛手多糖对·OH和·O2-的清除率分别为86.12%和35.87%。

3 结论

福建佛手皮渣中富含多糖物质，本研究通过超声波提取技术，获得建佛手多糖的最优提取工艺为：超声频率45 KHz、料液比1∶60、超声功率50 W、提取温度60 ℃、提取时间40 min，佛手多糖的提取率最高，可达3.32%。章斌等[8]研究了复合酶法提取广佛手多糖的工艺研究，工艺条件为酶用量1.2%、酶解时间150 min、料液比1∶40、酶解温度50 ℃,佛手多糖得率为4.13%。纪跃芝等[9]研究了水提法提取佛手多糖的最佳工艺设计，提取工艺条件为浸提时间1.5 h、提取温度100 ℃、料液比1∶20，多糖得率最高可达7.21%。王琴等[12]采用超声波法提取广佛手多糖，结果为超声波预处理25 min，料液比1∶30，热水浸提4 h，粗多糖得率为3.18%。本研究得出的提取率与章斌[8]、纪跃芝[9]等的研究结果差异较大，接近于王琴等[12]的研究结果，但在技术工艺上也存在较大差异。原因主要在于以下2个方面：一是提取原料不同，不同产地、不同部位佛手多糖含量有差异。本研究采用福建佛手加工中废弃的皮渣，为佛山加工中废弃物的高值化利用提供了技术参考。二是提取技术与测定方法不同，所选用参数不同。本研究采用蒽酮硫酸法，区别于其他文献中的苯酚硫酸法，蒽酮硫酸法条件温和、重现性好、线性范围广，但有报道说可能存在提取率偏高的问题[20-21]，可在后续研究中继续讨论。综上所述，本研究采用的超声波提取福建佛手多糖的工艺可行、省时高效。

图5 建佛手与VC对·O2-的清除能力

图6 建佛手与VC对·OH的清除能力

体外抗氧化活性试验表明，本研究提取的福建佛手皮渣多糖溶液有较好的抗氧化活性，在溶液浓度为0.2～1.4 mg/mL内，清除能力与浓度呈正比。当建佛手多糖质量浓度为1.4 mg/mL时,佛手多糖对·OH和·O2-的清除率分别为86.12%和35.87%。对·OH清除作用略低于同浓度的VC溶液。该研究结果增加了其开发利用的经济价值。