一测多评法在舒肝益脾颗粒中的应用

颜瑞琪，栗建明，顾利红，侯惠婵，袁震霆

(广州市药品检验所 国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广东 广州 510160)

舒肝益脾颗粒由五味子、茵陈、蒲公英、茯苓、山楂和黄芪组成，临床上主要用于治疗湿热阻滞而致的急、慢性肝炎、迁延性肝炎、胆囊类等病症。其中五味子为方中君药，具有补益肝肾、益气收精、滋肾固本的作用。五味子醇甲、五味子甲素(简称甲素)、五味子乙素(简称乙素)是五味子的主要有效成分，对化学毒物产生的肝脏损伤具有保护作用，对病毒早期的复制具有抑制作用，且对心血管系统和神经系统均有一定的调节功能[1]，是治疗肝胆类疾病较理想的药物。舒肝益脾颗粒为肝胆类疾病的临床常用药，但该品种标准繁多，且仅以五味子中单独某一成分为质量控制指标。在实际临床用药中，单一成分的含量并不能真实反映成品的质量，也不利于企业对成品的质量控制。

长期以来，我国传统中医药立足于整体理论，相较于单体药物具有显著优势[2-4]。中药及其复方的多成分、多作用靶点等特点，决定了任何一味中药或成方制剂的整体质量不能以单一某种成分进行评价。多指标综合质量控制模式将成为中药质量评价的发展趋势[5-8]。一测多评法(QAMS)自提出以来，受到众多药学工作者的认可，并在现行版《中国药典》及较多中药质量评价中得到广泛运用[9-19]。如2015年版《中国药典》将该方法的应用扩展至提取物等制剂的多指标质量控制，新增银杏叶片、银杏叶提取物、银杏叶胶囊及银杏叶滴丸、咳特灵片、咳特灵胶囊、黄连药材、丹参药材、生姜药材中典型成分的含量测定[20]。2020年版《中国药典》进一步扩大了一测多评法的应用范围，如新增穿心莲药材、淫羊藿药材、蟾酥药材等[21]。本文采用一测多评法，利用五味子醇甲与甲素、乙素含量之间的函数和比例关系，通过只测定一个成分实现多个成分的同步测定，可用于舒肝益脾颗粒五味子药味中主要化学成分的定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪(岛津公司)，配自动进样器(SIL-20AC)、柱温箱(CTO-20A)、检测器(SPD-M20A)；LabSolutions在线工作站；METTLER XP26电子天平、XS204电子天平(梅特勒公司)；Milli-Q Advantage A10 超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 药品与试剂

对照品：五味子醇甲(110857-201815，含量99.7%)、五味子甲素(110764-201714，含量99.3%)、五味子乙素(110765-201512，含量99.0%)，均购于中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯(德国Merck公司)，其他试剂为分析纯；实验用水为超纯水(美国 Millipore 公司)；样品分别来自M1、M2、M3等3个厂家，共12批；缺五味子的舒肝益脾颗粒阴性对照样品由广州莱泰制药有限公司提供。

1.3 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)；梯度洗脱程序：0～15 min，56%A；15～25 min，56%～75%A；25～44 min，75%A。柱温：30 ℃；检测波长：217 nm；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。

1.4 对照品溶液的制备

取五味子醇甲、甲素、乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含50 μg/mL五味子醇甲、10 μg/mL甲素、15 μg/mL乙素的混合溶液，即得。

1.5 供试品溶液的制备

取装量差异项下的供试品，研细，取本品约5.0 g或1.0 g(无蔗糖)，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，称定重量，超声处理(功率380 W，频率37 kHz) 30 min，取出放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀,过滤。精密量取续滤液25 mL，蒸至近干，残渣加甲醇溶解，并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。

1.6 阴性对照溶液的制备

取五味子阴性对照品适量，采用供试品溶液的制备方法制备五味子阴性对照溶液。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

参考《中国药典》2015年版一部“五味子”的检测波长250 nm[20]，本研究采用二极管阵列(PDA)检测器，分别提取五味子醇甲、甲素、乙素色谱峰在190～400 nm波长范围的紫外光谱扫描图，结果显示上述3种对照品在217 nm、250 nm波长附近均有最大吸收。考虑到甲素、乙素在250 nm处的响应值较弱，217 nm波长能同时兼顾3种成分，故最终选择检测波长为217 nm。

图1 混合对照品(A)、样品(B)与阴性对照品(C)的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A),sample(B) and negative control(C) 1.schisandrol(五味子醇甲),2.deoxyschisandrin(五味子甲素), 3.schisandrin B(五味子乙素)

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性实验分别精密吸取“1.4～1.6”配制的溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，供试品色谱图中出现五味子醇甲、甲素、乙素的色谱峰，且阴性对照品的色谱图中相应位置无干扰(见图1)。

2.2.2 标准曲线取五味子醇甲、甲素、乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成五味子醇甲、甲素、乙素质量浓度分别为0.250 6、0.125 2、0.168 9 mg/mL的混合对照品溶液，再稀释成不同质量浓度的系列溶液，按“1.3”色谱条件进行测定。以各成分的峰面积积分值为纵坐标(y)，对照品溶液的质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，计算得回归方程。结果表明：五味子醇甲、甲素、乙素在各自线性范围内均呈良好线性关系，相关系数(r)均为0.999 9。以3倍信噪比(S/N=3)对应的质量浓度计算检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)对应的质量浓度计算定量下限(LOQ)，结果见表1。结果显示,五味子醇甲、甲素、乙素的LOD为3.12～5.08 pg，LOQ为7.80～12.7 pg，能满足检测要求。

表1 3种成分的线性关系、检出限与定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of three components

2.2.3 精密度实验取同一混合对照品溶液(五味子醇甲、甲素和乙素的质量浓度分别为49.790、9.985、14.964 μg/mL)连续进样6次，记录峰面积，计算相对标准偏差(RSD)均为0.10%，说明仪器精密度良好。

2.2.4 重复性实验取本品1 g(无蔗糖样品：S7)或5 g(含蔗糖样品：S12)，按“1.5”方法平行制备供试品溶液各6份，在“1.3”色谱条件下进样测定。结果显示：无蔗糖型样品中五味子醇甲、甲素、乙素的含量分别为0.564 3、0.090 67、0.141 3 mg/g，RSD分别为1.4%、1.4%、1.5%；含蔗糖型样品中五味子醇甲、甲素、乙素的含量分别为0.127 9、0.061 57、0.087 75 mg/g，RSD分别为0.70%、1.5%、1.5%，表明方法重复性良好。

2.2.5 稳定性实验取供试品1 g(无蔗糖)和5 g(含蔗糖)，分别按“1.5”方法制备供试品溶液，按“1.3”色谱条件分别在0、4、8、16、24、30、36 h进样测定。各成分测得值的RSD均小于1.0%，表明供试品溶液在36 h内稳定。

2.2.6 加标回收率实验取已知含量的供试品约0.5 g(无蔗糖)和2.5 g (含蔗糖)各6份，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液50 mL，按“1.5”方法制备供试品溶液,采用本方法测定，计算五味子醇甲、甲素、乙素的回收率及RSD。结果表明，含蔗糖型颗粒中五味子醇甲、甲素和乙素的平均回收率分别为98.1%、101%、101%，RSD分别为0.40%、0.70%、0.50%；无蔗糖型颗粒的平均回收率分别为99.7%、99.9%、101%，RSD分别为0.80%、1.1%、0.90%。回收率及RSD符合方法学考察的相关要求。

表2 以五味子醇甲为参照的 fs/k(多点校正法)Table 2 fs/k with schisandrol as reference(multi-point correction method)

表3 不同仪器和色谱柱测得待测成分与五味子 醇甲的fs/k(n=6)Table 3 fs/k of three reference substances on different instruments and chromatographic columns(n=6)

2.3 相对校正因子的计算

2.3.1 多点校正法文献[22-24]采用以多个质量浓度点计算所得的相对校正因子(fs/k)取平均值作为定量用fs/k。计算公式：fs/k=(WkAs)/(WsAk)[25]。式中As和Ak分别为内参物和目标组分k的峰面积，Ws和Wk分别为内参物和目标组分k的质量浓度。取“2.2.3”的混合对照品溶液，分别进样2、5、7、10、15、20 μL，测定五味子醇甲、甲素、乙素的峰面积。以五味子醇甲为内参物(s)，分别计算五味子醇甲与甲素(fs/ds)、五味子醇甲与乙素(fs/sb)之间的校正因子，结果见表2。结果显示，在不同进样体积时，五味子醇甲与甲素、乙素的相对校正因子基本一致，分别为0.94和0.95。

2.3.2 斜率校正法通过标准曲线Y=aX+b可知，误差通常由截距(b)引起，当X=(Y-b)/a=Y/a-b/a，b与a比值小于0.01时，b/a值可以忽略。因此，公式进而简化为X=Y/a。故fs/k可通过二者的斜率a值之比直接计算(fs/k=as/ak)。继而通过公式Wk=fs/k×Ak/as，其中as为参照物的斜率，ak为其他对照组分的斜率，由参照物的标准曲线求得as，并计算五味子醇甲与甲素、乙素的fs/k分别为0.93、0.95。

2.4 fs/k的系统耐受性与重复性

取“2.2.3”的混合对照品溶液，分别于2台不同品牌的HPLC仪及3种不同品牌的C18色谱柱上按“1.3”色谱条件各进样6次，每次10 μL。分别测定各成分的峰面积，按“2.3.1”的公式分别计算五味子醇甲与甲素、乙素的fs/k及RSD，结果见表3。同时分别考察了流速、柱温对相对校正因子的影响，在柱温为25、40 ℃时，fs/ds、fs/sb分别为0.95、0.96和0.94、0.95；流速为0.8、1.2 mL/min时，fs/ds、fs/sb分别为0.95、0.95和0.94、0.95。结果显示，不同品牌的HPLC仪及色谱柱所得的fs/k基本相同，说明fs/k的系统耐受性较好。

2.5 待测成分色谱峰的定位

相同成分在不同的HPLC仪或色谱柱中的保留时间会存在较大差异。以“2.4”条件得到的相对保留时间(tR)和保留时间差(Δt)考察不同仪器和色谱柱的重现性，用于对目标成分进行定位(见表4)。结果显示，各待测成分相对保留时间的RSD均小于5.0%，且tR的RSD均小于Δt，表明相对保留时间更适用于待测成分色谱峰的定位。

表4 不同仪器和不同色谱柱下各目标成分的相对保留时间与保留时间差(n=6)Table 4 Relative retention times and differences in retention time of components under test on different instruments and chromatographic columns(n=6)

2.6 舒肝益脾颗粒中QAMS与ESM结果比较

取编号为S1～S12的供试品按“1.5”方法制备供试品溶液，按“1.3”色谱条件进样分析。采用外标法(ESM)计算五味子醇甲、甲素、乙素含量，再用建立的QAMS法以多点校正和斜率校正分别计算甲素、乙素含量，并对两种方法所得结果进行比较。结果显示，外标法、多点校正法、斜率校正法测得各成分的含量无显著差异(P<0.05)，证明QAMS法能够用于舒肝益脾颗粒的质量控制研究。

3 结 论

本文建立了以五味子醇甲为内参物，同时测定舒肝益脾颗粒中五味子醇甲、甲素、乙素含量的HPLC方法。结果表明，该方法准确度高、重复性好。一测多评法可减少对照品用量，降低实验成本，提高检验效率，是中药质量控制和评价模式新的发展趋势，是未来中药多成分质量评价模式的发展方向。该方法可用于舒肝益脾颗粒五味子药味中主要化学成分的定量分析，为提高及统一企业舒肝益脾颗粒的质量标准提供了依据和解决方案。