苗药大果木姜子挥发油对幽门螺杆菌的体外抑菌实验研究

吴碧清 吴贤倩 陈丽玄 鲍 杰 王 平

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃腺癌发生的主要诱导因素之一[1]。幽门螺杆菌是世界范围内常见的、具有强传染性的病原菌之一。有研究报道，全球有超过50%的人群感染此菌[2]。研究H.pylori致病机制，有效防治幽门螺杆菌相关性疾病已成为全球关注重大公共卫生健康问题。由于现阶段抗生素耐药性的增加，幽门螺杆菌根除率逐年下降。探索幽门螺杆菌感染治疗的新路径是当前研究的热点问题，其中中医药治疗引起越来越多的关注。中医药治疗幽门螺杆菌感染具有疗效确切、毒副反应小、根除率高等优势，是西药疗法的有益补充[3]。目前研究已发现多种中药具有明确的抗幽门螺杆菌作用。

大果木姜子是樟科樟属植物米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)的干燥成熟果实，味苦、辛，性温，能够散寒祛湿、行气止痛，常用于治疗胃痛、腹胀、腹痛、胸闷、呕吐等病症。主要分布在我国西南地区，如贵州、云南和广西等省，为贵州十大苗药之一[5-6]。研究发现，大果木姜子挥发油对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、表皮癣菌等具有较好的体外抑菌作用[7]。但目前尚未见其对幽门螺杆菌抑菌效果的相关报道。通过体外抑菌试验，发现大果木姜子挥发油对幽门螺杆菌有较强的抑菌作用，现将研究结果汇报如下。

1 仪器与材料

1.1 试验菌株幽门螺杆菌 ATCC26695由贵州医科大学微生物学教研室惠赠，由课题组保管于贵州中医药大学形态实验室。

1.2 材料 大果木姜子购自贵阳市万东药材市场，由贵州中医药大学药学院陈晓兰教授鉴定为正品。幽门螺杆菌固体培养基(HB8647)、脑心浸液肉汤干粉(HB8297-1)、幽门螺杆菌抑制剂(HB8646a，10 mL/支)购自青岛海博生物技术有限公司；无菌新鲜羊血购自贵阳超研生物科技有限公司；过氧化氢酶试剂(HB8650)、氧化酶试纸片(HB2100)购自于青岛海博生物技术有限公司；尿素酶试纸(121102)购自珠海市克迪科学技术开发公司；氨苄西林药敏纸片(AMP，10 ug)购自湖南长沙快迈生物科技有限公司；微需氧产气袋(8057ZJ-2，日本三菱)购自上海舒济生物有限公司。

1.3 仪器 ULTS1386超低温冰箱(美国赛默飞世尔科技公司)，BSC-1300 ⅡA2生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司)，SW-CJ-1FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，BNA610电热恒温培养箱(日本Yamato公司)，GI54DWSGI60DP立式压力蒸汽灭菌器(厦门致微仪器有限公司)，麦氏比浊仪(法国Biomerieux SA公司)，WND-2000高速中药粉碎机(浙江省兰溪市伟能达电器有限公司)，多功能酶标仪(瑞士Tecan Spark)。

2 方法

2.1 培养基的制备 固体培养基(平板)的制备参照说明书，称取幽门螺杆菌固体培养基15.6 g，加入279 mL纯水，高压灭菌(121℃，20 min)处理，待琼脂冷却至50～55℃时，加入无菌脱纤维羊血21 mL、幽门螺杆菌抑制剂30 mL，混匀，倾倒于90 mm无菌平皿，培养基厚度约为3～4 mm，冷却凝固后，4℃备用。液体培养基制备，脑心浸液3.85 g，加无菌纯水90 mL，高压灭菌，冷却后加10 mL胎牛血清，分装，保存于4℃冰箱备用。

2.2 幽门螺杆菌鉴定 在微需氧环境中(培养罐中放置微需氧袋)培养幽门螺杆菌48～72 h，连续培养3代，通过观察其菌落形态、生化试验(氧化酶试验、快速尿素酶试验、过氧化氢酶试验)以及革兰染色进行鉴定。接种环灭菌后刮取平板中疑似菌落放于氧化酶试纸片或快速尿素酶试纸条上，30 s至2 min内观察结果。氧化酶试纸在 30 s 内变为蓝色或蓝紫色为强阳性，2 min内不变色为阴性。快速尿素酶试纸在1～2 min内变红，则尿素酶试验为阳性，如果试纸条颜色不变，则尿素酶试验为阴性。过氧化氢酶试验根据说明书操作，在平板中可疑菌落上滴加1滴3%过氧化氢，观察有无气泡产生，如有气泡产生，判断为阳性。

2.3 幽门螺杆菌菌悬液制备 无菌接种环从平板中上刮取菌落于无菌生理盐水中稀释成菌悬液，采用比浊法(麦氏比浊仪)调整菌悬液浓度为1.5×108cfu/mL。

2.4 大果木姜子挥发油提取 称取大果木姜子50 g，加入三倍量水浸泡3 h后取出，在80 ℃烘干至恒重，粉碎成细粉备用；称取大果木姜子细粉，置圆底烧瓶中，加入12倍量水，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间为8 h，计算得油率，得油率(%)=油状液体体积/样品重量×100%。提取得到的挥发油置冰箱保存。

2.5 含药纸片的制备 用1% 二甲基亚砜(DMSO，以无菌去离子水为溶剂)将大果木姜子挥发油原液稀释成100 mg/mL溶液，再按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80浓度梯度用1%DMSO进行稀释，将灭菌后空白药敏纸片分别置于不同浓度的大果木姜子油溶液中充分浸透后，放37 ℃温箱内过夜，取出置阴暗干燥处存放，备用。以1% DMSO作为空白对照，氨苄西林(AMP)药敏纸片为阳性对照(10 μg/片)。

2.6 大果木姜子挥发油抑菌活性检测

2.6.2 最低抑菌浓度(MIC)测定 按2.5方法用1%DMSO将挥发油稀释至100 mg/mL，于96孔板中，用脑心浸液将药液对倍稀释。并将100 μL药液与1.5×108cfu/L菌悬液100 μL混合，使挥发油终浓度为50、25、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL。设置脑心浸液对照(阴性对照)、细菌生长对照(阳性对照)及1%DMSO溶媒对照。每孔做3个平行孔。微孔板震荡混匀后，放入厌氧罐中加入微需氧袋，置于37℃培养箱中培养72 h后观察结果。肉眼观察到无明显浑浊的最高药物稀释度即为大果木姜子挥发油的最低抑菌浓度(MIC值)。同时，利用酶标仪快速检测各孔在600nm处吸光值，测定细菌抑菌率(%)=[(阳性对照孔OD-阴性对照孔OD)-(药物孔OD-阴性对照孔OD)]/(阳性对照孔OD-阴性对照孔OD)，与肉眼观察获得的MIC值进行核对，当抑菌率大于90%，可认定MIC值可靠，若抑菌率小于90%，则重新判定MIC值(初判定浓度的上一个稀释梯度)，直至抑菌率符合判定标准[9-10]。

2.6.3 最低杀菌浓度(MBC)测定 按2.5.2方法在96孔板上将药物倍比稀释8个浓度后，与菌液混合，致药物最终浓度为50、25、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL，吹打混匀，每孔各吸取100 ul接种于血琼脂平板上，用涂布棒涂匀后置于37℃培养箱中微需氧培养72 h后观察结果，未出现菌落生长的最小浓度为最低杀菌浓度。

3 结果

3.1 大果木姜子挥发油得油率 水蒸气蒸馏法提取8 h，所得大果木姜子挥发油体积为3.2 mL，得油率为6.4%。

3.2 幽门螺杆菌固体培养基上生长现象观察及革兰氏染色结果 在固体培养基上幽门螺杆菌菌落为直径1～2 mm的透明针尖样菌落，融合成片(图1)。经涂片、固定、革兰染色后油镜下观察，革兰染色阴性，呈弧形、海鸥状弯曲或短杆状(图2)。氧化酶试验、快速尿素酶试验、过氧化氢酶试验均为阳性。

3.3 抑菌活性测定

3.3.1 抑菌圈 通过测定抑菌圈直径大小评价抑菌效果，结果见图3和表1。结果显示大果木姜子挥发油对幽门螺杆菌有较强的抑菌作用，阳性对照组及1∶10和1∶20药物浓度组抑菌圈直径均>15 mm；1∶40药物浓度组抑菌圈直径>6 mm，1∶80药物浓度组和溶媒(1%DMSO)对照组无抑菌圈。

表1 大果木姜子挥发油对H. pylori的体外抑菌效果

3.3.2 MIC和MBC测定结果 在对照组中，脑心浸液对照组(阴性对照)液体澄清，细菌生长对照(阳性对照)有菌生长，1%DMSO溶媒对照组有菌生长，提示1%DMSO无明显抑菌作用。表2示肉眼初测大果木姜子挥发油对幽门螺杆菌MIC值为6.25 mg/mL。表3示各浓度梯度药物OD600 nm吸光值，表4为各浓度梯度下，大果木姜子挥发油抑菌率，结果显示，药物浓度为6.25 mg/mL时，抑菌率为90.63%，达到抑菌率判定药物MIC的标准(≥90%)，因此，大果木姜子挥发油对幽门螺杆菌MIC值为6.25 mg/mL。由表5可知，药物浓度为12.5 mg/mL时，培养基中未见幽门螺杆菌生长，大果木姜子挥发油对幽门螺杆菌MBC值为12.5 mg/mL。

表2 大果木姜子对H.pylori最低抑菌浓度

表3 各浓度梯度药物OD600nm值

表4 各浓度梯度药物孔对应的抑菌率 (%)

表5 大果木姜子对H. pylori最低杀菌浓度

4 讨论

幽门螺杆菌是一种能够在胃中生存的革兰阴性微需氧细菌。1982年Barry J Marshall和J Robin Warren第一次在体外发现了幽门螺杆菌的存在[11]。现代研究表明，幽门螺杆菌感染是慢性胃炎、消化性溃疡和胃腺癌发生的主要诱导因素之一。幽门螺杆菌已被世界卫生组织国际癌症研究机构列为第一类致癌原[12]。虽然大部分幽门螺杆菌感染者可能终身无症状，但10%感染者可发展为消化性溃疡，不到1%可能发展为胃癌或粘膜相关淋巴组织淋巴瘤。因此，《幽门螺杆菌胃炎京东全球共识报告》推荐对所有幽门螺杆菌感染者进行根除治疗，除非有抗衡方面考虑[13-14]。目前，西药根除幽门螺杆菌疗效受抗生素耐药及不良反应等因素的影响，临床研究发现，应用中药或中西医结合治疗可显著提高幽门螺杆菌根除率，在改善临床症状、降低西药副作用方面有显著优势[15]。

幽门螺杆菌感染引起的慢性胃炎可以归结于祖国医学的“胃脘痛”，脾胃虚寒是其临床证型之一，贵州苗族药物心胃止痛胶囊(又名心胃丹胶囊)具有温胃散寒、理气止痛的功效。对于急、慢性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡，胃脘疼痛，腹部胀满，反酸呕恶等有特殊疗效，对胃脘疼痛等症状的改善效果尤为显著[16]，大果木姜子是心胃止痛胶囊的主药之一[17]。近年来，国内学者对大果木姜子的活性成分及药理作用进行了大量的研究，研究发现其挥发油可能是药理作用的主要成分之一。本实验采用传统的水蒸气蒸馏法提取大果木姜子挥发油，得油率为6.4%。本实验研究发现，大果木姜子挥发油对幽门螺杆菌有较好的抑制作用，其抑菌圈直径与氨苄西林类似，MIC和MBC值分别为6.25 mg/mL和12.5 mg/mL，与文献报道的高度敏感的抗幽门螺杆菌中药黄连的MIC和MBC值接近[18]。这可能是心胃止痛胶囊可以有效改善幽门螺杆菌相关胃炎症状的一个重要原因。大果木姜子抗幽门螺杆菌作用机理及物质基础值得进一步深入研究。