解毒消癌方对脑胶质瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的影响Δ

高 爽

(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院神经外科，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑胶质瘤是恶性程度最高的神经系统肿瘤，其呈浸润性生长，手术难以完全切除，临床一般采取手术、放疗和化疗等多种治疗手段联合干预，但死亡率仍高达98%，中位生存期<15个月，5年生存率<5%[1-2]。脑胶质瘤的整体治疗缺乏突破性进展，寻找有效治疗方法仍是临床研究的热点。中医药具有悠久的历史，目前关于中药治疗恶性肿瘤的研究也越来越多，得到了广泛的关注。中药成分复杂，尤其是中药组方，能够从多途径、多靶点和多环节发挥抗肿瘤效果，在恶性肿瘤的治疗中具有巨大的潜力和优势。国医大师周仲瑛教授根据“癌毒理论”创立了解毒消癌方，其在多种恶性肿瘤的治疗中显现出了确切的疗效。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是恶性肿瘤侵袭和转移的关键步骤之一[3]。本研究就解毒消癌方对大鼠脑胶质瘤细胞侵袭、迁移及EMT的影响展开研究，以期为解毒消癌方在临床治疗中的应用提供依据，现报告如下。

1 材料

1.1 细胞株

胶质瘤细胞株SHG44购自美国菌种保藏中心。BALB/c Nude裸鼠，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2016-0011。

1.2 药品

解毒消癌方：白花蛇舌草(20 g)，山慈菇(6 g)，八月札(15 g)，僵蚕(10 g)，蜈蚣(3 g)，太子参(12 g)，麦冬(6 g)；由哈尔滨医科大学附属肿瘤医院中药房提供，经鉴定符合《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)的要求。生药经10倍量的双蒸水浸泡60 min，加热煎煮1 h(微沸状态开始计时)后滤出药液，加水重复煎煮1 h，将2次滤出的药液混匀，以旋转蒸发仪浓缩至1 000 ml时改用电磁炉加热，至玻璃棒挑起时呈面状滴下；放入真空干燥箱过夜，粉碎密封保存。按实验要求配制成各浓度溶液。

1.3 试剂

RPMI-1640培养基、胎牛血清购自南京森贝伽生物科技有限公司；胰酶-EDTA购自美国CHI Scientific公司；PBS缓冲液购自武汉博士德生物工程有限公司；丝裂霉素C购自美国Sciencell公司；多聚甲醛购自美国EMS公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司；RIPA蛋白裂解液、琼脂糖和DAB测定试剂盒购自上海一基实业有限公司；BCA蛋白检测试剂盒购自美国Abacm公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自美国EZBiolab公司；PVDF膜、TGF-β、ZEB-1、snail和MMP-9抗体购自美国millipore公司；一抗二抗去除液购自上海碧云天生物科技有限公司；ECL发光液购自上海炎熙生物科技有限公司。

1.4 仪器

2406-2型CO2培养箱(美国shellab公司)；CHJH-C2109B型超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；DYCZ-25D型蛋白电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；Fluor Chem FC2型电泳凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司)；CP100WX/CR22N型超速冷冻离心机(日本HITACHI公司)；Transferpette型微量移液器(德国Brand公司)；SH 100型水平摇床(上海达姆实业有限公司)；IX73型荧光倒置显微镜(日本Olymplus公司)。

2 方法

2.1 细胞处理

将含有1 ml细胞悬液的冻存管在37 ℃水浴锅中快速解冻，加入4 ml培养基混合均匀；加入离心管中以1 000 r/min的转速离心分离5 min，弃置上清液，补加适量培养基并吹匀，标记细胞种类和复苏日期。接种于6孔培养板，于5%CO2、95%空气，37 ℃，相对湿度90%的培养箱中培养24 h，观察细胞状态并继续培养。细胞密度达到85%左右时进行传代培养，弃置培养上清，以PBS缓冲液(不含钙、镁离子)清洗2次；加入0.25%胰酶1 ml，消化1～2 min；显微镜下观察到细胞变圆并脱落时，加入少量完全培养基终止反应。适量补加培养基，轻轻打匀后吸出，以1 000 r/min的转速离心分离5 min，弃置上清液，再次补加培养基并吹匀，按1∶2的比例进行传代。待细胞生长状态良好，处于对数生长期时冻存，-80 ℃冰箱保存24 h后转入液氮灌储存。

2.2 细胞划痕实验

取对数生长周期细胞，加入胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔1×105个的密度接种于6孔板中。按实验设计分组并更换培养液，分为空白对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组(分别加入0、25、50及100μg/ml解毒消癌方水提物)，每孔200 μl，设5个复孔。细胞覆盖达到90%时，采用200 μl无菌枪头垂直于孔板底部划平行直线；以PBS清洗2次，更换为无血清培养基。正常条件下继续培养，12、24及48 h后采用显微镜(100×)观察并拍照，计算各组迁移距离。

2.3 Transwell侵袭实验

将冻存的Matrigel基质胶置于冰箱4 ℃过夜，变成液态后使用无血清培养基按1∶3的比例稀释，上室加入50 μl，37 ℃条件下于培养箱中放置2 h；取对数生长周期细胞消化后，加入胰酶消化，计数，制成单细胞悬液；将细胞悬浮于含有0、25、50及100 μg/ml解毒消癌方水提物的无血清培养基(即为空白对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组)，以1×104个/孔的密度接种于上室；下室加入含20%胎牛血清培养基500 μl；培养24 h后取出小室，以PBS清洗2次，擦去上层基质胶和细胞，4%多聚甲醛固定，Giemsa染色；洗取染色液后于倒置显微镜(200×)下观察侵袭至微孔膜下层的细胞计数，每孔均随机选择5个视野计数，取平均值作为该组侵袭细胞数。

2.4 体内实验

将生长状态良好的SHG44细胞注射入裸鼠背部，共20只，每只裸鼠注射的细胞保持在5×106个，观察肿瘤生长情况，当肿瘤体积(1/2长×宽2)[4]达到150 mm3时，将其随机分为空白对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组4组，每组5只，分别给予0、25、50及100 μg/ml解毒消癌方喂养；每5 d测量1次肿瘤大小，5周后处死，取出肿瘤，消化肿瘤组织，按照蛋白质印迹法检测肿瘤组织中相关蛋白分子表达情况。

2.5 蛋白质印迹法检测相关蛋白

处理好的细胞弃上清液，以PBS清洗2次，加入细胞裂解液，使用移液器吸取混合液至EP管，冰上裂解30 min；离心机预冷至4 ℃，将混合液以12 000 r/min的转速离心分离10 min；按BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。每孔40 μg蛋白，加入上样缓冲液，2%琼脂糖凝胶，10%SDS-PAGE电泳；80 V恒压跑浓缩胶，蛋白跑至分离胶时调高电压至120 V，蛋白跑至胶底端时停止电泳；裁剪PVDF膜，以甲醇浸泡后放入转膜液中清洗，恒流300 mA转膜90 min；完成转膜后取出PVDF膜转移至5%BSA封闭液中，以室温摇床慢摇1 h；加入TGF-β、ZEB-1、snail、MMP-9和GADPH抗体，4 ℃过夜；以TBST溶液清洗条带3次，1次10 min；加入二抗，孵育1 h;再次以TBST溶液清洗3次，1次10 min；将ECL发光液(A液、B液体积比=1∶1)均匀沾到膜上后放入凝胶呈现系统中显影拍照，收集分析数据。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 解毒消癌方对胶质瘤细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示，肿瘤细胞经解毒消癌方处理后，低、中及高剂量组细胞迁移距离明显短于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，细胞迁移能力受到明显抑制；中剂量组相对低剂量组迁移能力抑制更明显，高剂量组迁移能力相对中剂量组迁移能力抑制更明显，差异均有统计学意义(P<0.05)；解毒消癌方对胶质瘤细胞迁移能力的抑制呈时间和浓度依赖性，时间越长、浓度越高，细胞迁移能力越弱，见表1、图1。

表1 四组细胞迁移距离比较Tab 1 Comparison of cell migration distance among four groups

图1 四组细胞迁移距离比较Fig 1 Comparison of cell migration distance among four groups

3.2 解毒消癌方对胶质瘤细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，肿瘤细胞经解毒消癌方处理后，低、中及高剂量组侵袭细胞数明显低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，细胞侵袭能力受到明显抑制；中剂量组相对低剂量组侵袭能力抑制更明显，高剂量组侵袭能力相对中剂量组迁移能力抑制更明显，差异均有统计学意义(P<0.05)；且解毒消癌方对胶质瘤细胞侵袭能力的抑制呈浓度依赖性，浓度越高，细胞侵袭能力越弱，见表2、图2。

表2 四组侵袭细胞数比较Tab 2 Comparison of invasive cells among four groups

图2 四组侵袭细胞数比较Fig 2 Comparison of invasive cells among four groups

3.3 解毒消癌方对胶质瘤细胞TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9蛋白表达的影响

蛋白质印迹法检测结果显示，经解毒消癌方喂养后，大鼠胶质瘤细胞TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9蛋白表达明显降低，低、中及高剂量组均低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9蛋白表达受到抑制；且中剂量组明显低于低剂量组，高剂量组明显低于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；解毒消癌方对TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9蛋白表达的抑制呈浓度依赖性，浓度越高，表达水平越低，见表3、图3—4。

表3 四组细胞TGF-β、ZEB-1、snail、MMP-9蛋白相对表达水平比较Tab 3 Comparison of relative expression levels of TGF-β, ZEB-1, snail and MMP-9 among four groups

图3 四组细胞TGF-β、ZEB-1、snail、MMP-9蛋白相对表达水平比较Fig 3 Comparison of relative expression levels of TGF-β, ZEB-1, snail and MMP-9 among four groups

图4 蛋白电泳图Fig 4 Protein electropherogram

4 讨论

胶质瘤在颅内肿瘤等级划分中始终处于最高级(Ⅳ级)，具有侵袭能力强、复发率和死亡率高的特点[5]。如何延长胶质瘤患者的生存期，提高患者的生活质量，始终是临床研究的热点。

中医理论并无胶质瘤这一名词，可纳入“真头痛”“眩晕”等范畴[6]。血气不通则停留为瘀，津液无法正常输布则留结为痰[7]。癌毒留结是肿瘤发病的根本，在损伤脏腑功能、损耗人体正气的同时还会流窜到其他脏腑，形成原发灶和转移灶[8]。虚实两端是胶质瘤病机要素，虚者以气虚、阴伤为主，实者以血瘀、痰浊为主[9]。根据癌毒特点，结合病机要素，以“扶正祛邪”为基本治疗原则。在胶质瘤的治疗中应以解毒消癌法为主导，以扶正姑息治疗为辅。

本研究所采用的解毒消癌方由清热解毒药白花蛇舌草、山慈菇，理气活血药八月札，息风止痉药僵蚕、蜈蚣和扶正补气药太子参、麦冬组成。其中，白花蛇舌草清热解毒、利湿通淋；山慈菇清热解毒、化痰散结；僵蚕祛风止痛、化痰散结；蜈蚣熄风镇痉、攻毒散结、通络止痛；八月札舒肝理气、活血散瘀；太子参益气健脾、润肺生津；麦冬养阴生津、润肺清心。全方攻补兼施，共奏清热解毒、祛邪扶正、化痰散结之功。该方是临床实践中治疗恶性肿瘤颇具疗效的经验方，对多种恶性肿瘤的生长具有抑制作用。马艳霞等[10]经研究证实，“消癌解毒方”能够抑制H22荷瘤小鼠移植瘤生长，降低肿瘤转移和复发的可能性。本研究结果发现，经解毒消癌方水提物培养的胶质瘤细胞株SHG44的迁移距离和侵袭细胞数均明显缩短和降低，且随着药物浓度升高，缩短和降低幅度越明显，证实解毒消癌方在抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭方面具有良好的效果，且呈剂量依赖性。

胶质瘤细胞是否发生经典EMT一直存在争论，这是由于在大部分胶质瘤细胞中无法检测到上皮钙黏素(E-cadherin)，而上皮钙黏素是上皮细胞最主要的表型分子[2,11-13]。本研究中也并未检测到该分子。EMT过程中除了上皮钙黏素下调，也表现为其他间质细胞的标记分子上调。研究结果发现，snail mRNA在多种间质转变的肿瘤细胞中高表达，其不但能抑制细胞向上皮细胞转变，还能够提高肿瘤细胞的迁移、侵袭能力[14]。ZEB-1是EMT的重要调控基因之一，在促进肿瘤细胞EMT，增强迁移、侵袭能力的同时还能使肿瘤细胞具备肝细胞的特征[15]。赵丽艳等[16]的研究结果显示，沉默ZEB1基因表达可抑制胶质瘤U87细胞EMT。ZEB-1和snail是EMT的2个重要转录因子，各自独立进行负反馈调节的同时还能形成双向负反馈调节，共同在EMT发生发展过程中起到调控作用。本研究中，蛋白质印迹法检测结果显示，经25、50及100 μg/ml解毒消癌方喂养的裸鼠移植瘤内ZEB-1、snail蛋白水平均低于空白对照组，证实解毒消癌方能够抑制EMT转录因子，从而抑制EMT的发生。

MMP-9降解细胞外基质是胶质瘤迁移、侵袭的重要原因[17]。通常MMP-9高表达的胶质瘤患者预后较差。研究结果证实，MMP-9高表达会促进EMT的发生，EMT的发生也会反向促进MMP-9表达升高[18]。因此，下调MMP-9水平对肿瘤细胞的迁移具有较好的抑制效果。本研究结果显示，解毒消癌方能够下调MMP-9水平，且呈剂量依赖性，提示其具有抑制细胞迁移和侵袭的作用，也与细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果相吻合。TGF-β是一种多肽性生长因子，早期能抑制肿瘤生长，但会促进晚期肿瘤的发展。在胶质瘤等部分恶性肿瘤中，TGF-β呈高表达，能够促进细胞发生EMT，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[19]。本研究结果显示，解毒消癌方能够降低TGF-β蛋白表达水平，提示解毒消癌方可能通过下调TGF-β表达而发挥作用。但本研究并未就TGF-β是否为解毒消癌方调控胶质瘤细胞EMT的上游作用靶点展开研究，期望在今后的实验中展开更深入的研究。

综上所述，解毒消癌方能够阻止胶质瘤细胞EMT，进而抑制细胞侵袭、迁移，其作用机制与下调细胞中TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9等多种效应蛋白表达有关。