高效液相色谱法测定大鼠血浆中倍半萜内酯类化合物苍耳亭的浓度Δ

曹 秀，韩静文，吴 妍，李会婷，马旖旎，陈卫东，史天陆,#

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012； 2.中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)药剂科，安徽 合肥 230036)

苍耳为菊科苍耳属植物，广布我国各地区，《中华人民共和国药典：一部》收录苍耳子作为药用，主要用于通鼻窍、祛风湿[1-3]。苍耳亭经有机溶剂提取自苍耳中[4-5]，属于倍半萜内酯类，α、β-不饱和羰基-γ内酯结构是其发挥活性的结构[6]。研究结果发现，苍耳亭在体内外均有较好的促进多种细胞凋亡和抗肿瘤作用[7-12]；此外，其还具有抑菌、抗过敏反应、抗溃疡及抗抑郁等作用[13-18]。本课题组前期研究结果发现，苍耳亭体内外具有抗肝癌细胞的作用[19]。药物的体内浓度高低与其药理作用的相关性很大，故本课题组拟进一步探讨苍耳亭在体内的药物浓度情况。目前，有关苍耳亭体内外含量测定方法的研究较少，尚未见有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定苍耳亭体内浓度的研究报道。故本研究拟尝试建立HPLC法测定大鼠血浆中苍耳亭的浓度，为其体内药物分析和药动学研究提供方法基础。

1 材料

1.1 仪器

LC-2010AHT型岛津高效液相色谱仪(紫外检测器，四元低压泵，自动进样器，LabSolutions Version 5.51色谱工作站)；FA2004B型电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)；KJ-202型振荡器(江苏康健医疗用品有限公司)；TGL-16B型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；NDK200型氮吹仪(上海皓庄仪器有限公司)；移液枪[大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，规格：10、100及1 000 μl]。

1.2 药品与试剂

苍耳亭标准品(南京植翠生物科技有限公司，批号为SZ201911108CET；纯度>98%)；内标物奥硝唑标准品(中国食品药品检定院，批号为100608-201102)；甲醇为色谱纯(西陇科学股份有限公司，批号为1908011)；实验用水为灭菌注射用水(石家庄四药有限公司，批号为1905093202)；二氯甲烷(无锡市展望化工试剂有限公司，批号为180701)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil ODS2柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；柱温为25 ℃；流速为1.0 ml/min；检测波长为278 nm；流动相为甲醇-水(V∶V=52∶48)；进样量为10 μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 标准储备液的制备：精密称取苍耳亭标准品10 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1 mg/ml的标准储备液，置于4 ℃冰箱中避光储存。

2.2.2 标准溶液的配制：取标准储备液，用适量甲醇溶解成1、2.5、5、10、20、50及100 μg/ml的标准系列溶液，置于4 ℃冰箱中避光储存。

2.2.3 内标奥硝唑溶液的配制：精密称取内标物奥硝唑10 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为1 mg/ml的内标储备液。用甲醇稀释成浓度为100 μg/ml的内标工作液，置于4 ℃冰箱中避光储存。

2.3 血浆样品的处理

取大鼠血浆样品100 μl，置于1.5 ml一次性离心管中，加入内标工作液10 μl充分振摇1 min后，再加入二氯甲烷溶液1 ml，涡旋混匀3 min，离心(4 000 r/min，5 min)，下清液转移至另一干燥的一次性离心管中，45 ℃氮气吹干，残留物以100 μl甲醇溶解，涡旋1 min，离心(12 000 r/min，10 min)，取上清液80 μl按“2.1”项下色谱条件进样分析。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性考察：分别取大鼠空白血浆、空白血浆加奥硝唑溶液(100 μg/ml)、空白血浆加苍耳亭溶液(15 μg/ml)、空白血浆加奥硝唑溶液(150 μg/ml)和苍耳亭溶液(2 μg/ml)，按“2.3”项下方法测定，见图1。由图1(B)和图1(C)可知，奥硝唑、苍耳亭的保留时间分别为3.906、6.810 min，在选择的色谱条件下，两者分离度较好(R>1.5)，且内源性物质不干扰测定，该方法的专属性良好。

A.空白血浆；B.空白血浆加100 μg/ml奥硝唑；C.空白血浆加15 μg/ml苍耳亭；D.空白血浆加150 μg/ml奥硝唑和2 μg/ml苍耳亭A. blank plasma; B. blank plasma mixed with 100 μg/ml ornidazole; C. blank plasma mixed with 15 μg/ml xanthatin; D. blank plasma mixed with 150 μg/ml ornidazole and 2 μg/ml xanthatin图1 苍耳亭HPLC图Fig 1 HPLC of xanthatin

2.4.2 标准曲线和定量下限：取大鼠空白血浆90 μl，分别加入苍耳亭标准系列溶液10 μl，制成相当于苍耳亭质量浓度为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5及10 μg/ml的模拟血浆样品，按“2.3”项下方法操作，进样10 μl，记录色谱图，以苍耳亭质量浓度为横坐标(X，μg/ml)，苍耳亭与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y)，用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程：Y=0.530 1X+0.022 5(R2=0.999 7)。定量下限为0.1 μg/ml，苍耳亭血浆浓度在0.1～10 μg/ml范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度试验：取大鼠空白血浆90 μl，按“2.4.2”项下方法制成低、中及高3个质量浓度(苍耳亭终质量浓度分别为0.1、1及10 μg/ml)的样品溶液，按“2.3”项下方法处理，每个质量浓度5个样本，连续测定3 d，根据当日的标准曲线，计算样品溶液的浓度，计算日内与日间精密度，用相对标准差(RSD)表示，见表1。

表1 日内精密度和日间精密度结果(n=5)Tab 1 Results of intra-day and inter-day precision test(n=5)

2.4.4 提取回收率：按“2.4.2”项下方法制备苍耳亭质量浓度为0.25、1及10 μg/ml的模拟血浆样品，按“2.3”项下方法处理，每个质量浓度5个样本，进样分析测得苍耳亭峰面积，将所得的苍耳亭峰面积与用流动相配制的同浓度苍耳亭峰面积的比值作为提取回收率。低、中及高浓度的提取回收率分别为89.19%、83.56%及96.72%，RSD分别为9.54%、3.47%及8.91%。

2.4.5 稳定性试验：取大鼠空白血浆90 μl，按“2.4.2”项下方法操作，制成质量浓度为0.25、1及10 μg/ml的模拟血浆样品，每个质量浓度5个样本，进样分析，于室温(25 ℃)放置4 h，-20 ℃冷冻7 d和经历3次反复性冻融后测定样品中苍耳亭的含量，将测得结果分别与0 h对比，计算相对比率和RSD，结果见表2。

表2 苍耳亭在大鼠血浆中的稳定性考察结果(n=5)Tab 2 Investigation of stability of Xanthing in rat plasma(n=5)

3 讨论

目前，关于苍耳亭体内分析方法的研究较少。徐圣秋等[20]通过HPLC法测定了不同采收期苍耳草中苍耳亭的含量，但其研究中的色谱条件及其样品前处理方法不适用于血浆样品。Yan等[21]采用超高效液相色谱与四级杆-线性离子阱串联质谱联用技术首次测定了大鼠单次给药后血浆中苍耳亭浓度，但该法的精密度和回收率均较低，且测定浓度范围内的线性相关性较差。一般常用的体内药物浓度检测方法主要有HPLC和液相色谱-质谱法(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)等，但LC-MS成本较高，不适于普通实验室开展课题研究。因此，为提高大鼠血浆中苍耳亭定量方法的回收率和线性相关性，本研究在已有实验室条件下，进一步优化苍耳亭体内药物浓度检测条件，对HPLC法测定大鼠血浆中的苍耳亭浓度进行了相关探索。

在流动相选择和优化方面，对实验流动相从甲醇-水(V∶V=60∶40)调整至甲醇-水(V∶V=52∶48)进行筛选，随着水比例增加，苍耳亭的保留时间逐渐延长；在甲醇-水(V∶V=52∶48)时内源性物质对内标和苍耳亭峰的干扰最小，且两者分离度较好，最终确定以甲醇-水(V∶V=52∶48)作为流动相。

在内标物选择方面，研究初期拟用对氨基苯甲酸(PABA)作内标，但PABA性质不稳定，其保留时间为2.2 min，而血浆中有杂质峰干扰，故调整内标，选用了奥硝唑，后期实验也验证了该内标性质稳定可靠，与苍耳亭在血浆分析过程中互不干扰。

在血浆样本前处理方面，血浆样品经甲醇直接萃取进样，干扰峰较多，且提取回收率低；其他研究中选用乙酸乙酯作萃取剂[21]，但在本研究条件下重现性不佳，且氮气吹干时间较长，故考虑用性质相似的二氯甲烷萃取。

在稳定性考察方面，将实验过程中配制的标准溶液置于4 ℃冰箱中避光储存，每隔1周检测发现标准溶液含量均不同程度的降低，故考察药物稳定性时选用0 h作为参考，以此来减少因保存过程中药物含量下降等干扰。将含有低、中及高浓度的苍耳亭血浆样品置于-20 ℃冰箱，于30 d中冷冻和反复冻融3次后检测，血浆样品中苍耳亭含量几近于零。考虑含有苍耳亭的血浆样品不适宜长时间放置冰箱冷冻，故将含有低、中及高浓度的苍耳亭血浆样品置于-20 ℃冰箱冷冻7 d和7 d内反复冻融3次后，测得样品的回收率和精密度均较好；但反复冻融后样品检测的精密度较冷冻时低，建议含有苍耳亭的血浆样品在短时间内尽快处理，且尽量减少反复冻融的次数。由上可见，在实际操作中需采取更好的避光和密封方式，以更好地保存血浆样品中的苍耳亭。

综上所述，本研究建立了灵敏、快速且简单的HPLC方法，可为苍耳亭药动学研究奠定基础。