有机磷阻燃剂TDMPP 对斑马鱼早期器官发育毒性的研究

宋唯一 刘景 白琼琼 武希玲 张金鹏 殷德辉

阻燃剂(flame retardant,FR)是一类赋予易燃聚合物难燃性的功能化合物,广泛应用于多种行业,如塑料、粘合剂、橡胶和染料等。阻燃剂在自然环境中易残留,且能在生物体内蓄积,尤其是脂肪组织,因此,阻燃剂对人群的毒理学影响以及潜在的生态风险已经引起国际 公共卫生领域学者的广泛关注［1］。目前已有研究表明,用于阻燃的化学品,如多溴化,二苯醚(BDEs)可损害大脑发育,导致内分泌紊乱,干扰生殖功能和导致患癌风险等［2,3］。因此,许多国家/地区严格规范了某些五溴二苯醚和八溴二苯醚技术配方的使用,例如 BDE-99、BDE-47 和BDE-183。十溴二苯醚最近被《斯德哥尔摩公约》列为持久性有机污染物 POPs［4］。除溴系阻燃剂外,磷酸盐阻燃剂同样应用广泛。目前市面已经开发出多种商用低聚有机磷阻燃剂替代多溴二苯醚等传统的溴系阻燃剂［5］,TDMPP 近年被确定为是PBDMPP 阻燃剂配方中的杂质［6］。体外研究表明,TDMPP 能够激活雌激素受体(ERα),其效力为雌二醇(E2)的 1/10000,具备干扰内分泌系统的潜力［7］。然而对磷酸盐阻燃剂体内毒理影响的评估尚不完善,关于TDMPP 的系统性毒理学评价尚未见报道。本研究中,应用多种斑马鱼转基因品系,对新型的有机磷阻燃剂TDMPP 进行系统性毒理学评价,包括急性毒性、发育毒性和器官毒性等,从而为TDMPP 的市场应用和危险度评估提供证据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 TDMPP、MS-222、甲基纤维素、亚甲基蓝等均购于美国Sigma 公司。尼康荧光体式显微镜Nikon SMZ18,Digit Sight DS-Fi2。上海海圣斑马鱼养殖系统,Z-A-D5,交配盒。培养箱,HPX-9052MBE。水浴锅,金坛良友HH-3A。

1.2 斑马鱼品系及养殖 肝胰脏双标记斑马鱼品系Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP)购于国家斑马鱼中心。采用全套斑马鱼自动化养殖系统,水温 28℃,pH=(7.3±0.2),电导率500～550 μS/cm,氧饱和度≥80%。喂食丰年虫2 次/d。所以实验步骤严格遵守徐州医科大学动物伦理委员会的相关规定。

1.3 TDMPP 暴露实验 将50 mM TDMPP 储液用系统水倍比稀释至0～2000 μM。以6 孔板为容器,随机选取270 颗2 h pf 的肝脏胰腺双标记转基因斑马鱼胚胎于6 孔板中,将2 h pf 受精卵随机分为处理组和对照组,每孔30 颗受精卵,每组2 个复孔,确保各组乙醇浓度均＜0.01%,连续暴露至72 h pf。72 h 后,将幼鱼麻醉后(0.03% MS-222),在荧光体视镜下观察各组幼鱼肝脏及胰腺的发育形态并拍照。随后,统计各组幼鱼存活率,应用 SPSS 软件计算半数致死量(LC50)。根据LC50,选取 10 μM 和 100 μM 分别作为低浓度组和高浓度组进行后续研究。相同的处理方式,72 h 后进一步观察各组中幼鱼的畸形率、出壳率、心率等。

1.4 观察指标 分析不同TDMPP 浓度对斑马鱼幼鱼致死、生长及出壳的影响,TDMPP 早期暴露对斑马鱼幼鱼的致畸作用,不同浓度TDMPP 对斑马鱼肝脏及胰腺的发育毒性影响。

1.5 统计学方法 采用 GraphPad 6.0 对实验数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t 检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),多重比较应用 Tukey 分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同TDMPP 浓度对斑马鱼幼鱼致死、生长及出壳的影响分析 TDMPP 对斑马鱼致死、出壳、身长的影响在一定浓度范围内,TDMPP 浓度与幼鱼死亡率呈正相关(r=0.8707,P＜0.05)。见图 1A～1B。浓度达到2000 μM 时导致全部幼鱼死亡,死亡率为 100%。TMDPP对斑马鱼胚胎的24h LC50 为1792 μM,72 h LC50 为1195 μM。在处理到72 h pf 时,与对照组相比,TDMPP 高浓度组(100 μM)能够显著抑制斑马鱼幼鱼生长(P＜0.01),而TDMPP 低浓度组与对照组比较差异无统计学意义(P=0.9832＞0.05),见图1C。检查72 h出壳率时,出壳率与暴露浓度呈现正相关(r=0.9078,P＞0.05)。见图1D。

图1 不同TDMPP 浓度对斑马鱼幼鱼致死、生长及出壳的影响

2.2 TDMPP 早期暴露对斑马鱼幼鱼的致畸作用分析 72 h pf 时形态学观察发现,TDMPP 对斑马鱼的致畸作用主要体现在心包水肿、脊柱畸形、腹腔水肿和色素形成异常等。见图2A～F。定量分析显示,低浓度组和对照组的表型率比较差异无统计学意义(P=0.2726＞0.05),但高浓度组与对照组的表型率比较差异具有统计学意义(P=0.0022＜0.05)。对于其他三种表型,可以发现相似的情况,100 μM TDMPP 早期暴露导致脊柱弯曲、腹腔水肿和色素减弱的表型率均显著高于对照组,差异具有统计学意义(P=0.0244、0.0072、0.0118＜0.05)。图2G～J。

2.3 不同浓度TDMPP 对斑马鱼肝脏及胰腺的发育毒性影响分析 TDMPP(10 μM 和 100 μM)处理3 d 后,应用转基因斑马鱼在体式荧光显微镜下观察肝脏形态。对照组可以看到清晰的红色荧光标记的肝脏,形态正常。见图3A。然而 TDMPP 处理组能够观察到明显的肝脏异常形态,发育受到阻滞,且呈现显著的剂量-效应关系。Image pro 定量分析进一步确认,处理组斑马鱼个体的肝脏尺寸小于对照组,100 μM 高浓度组与对照组和低浓度组比较,差异具有统计学意义(P=0.0019、0.0274＜0.05)。见图3B。TDMPP 早期暴露对胰腺发育同样有显著的抑制作用。见图 3A。低浓度组和高浓度组中幼鱼胰腺尺寸均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.0016、0.0009＜0.05)。见图3C。

图2 TDMPP 早期暴露对斑马鱼幼鱼的致畸作用

图3 不同浓度TDMPP 对斑马鱼肝脏及胰腺的发育毒性影响

3 讨论

本研究针对新型有机磷阻燃剂 TDMPP 进行了系统全面的毒理学评价,包括致死率、致畸率、出壳率和心率等。同时应用多种高效的转基因斑马鱼品系,评估TDMPP 早期暴露对肝脏、胰腺及心脏的发育毒性。

本研究发现,TDMPP 早期暴露可诱导幼鱼出现明显心包水肿、脊柱弯曲、腹腔水肿和色素形成异常等表型,且高浓度组变化明显。出壳是胚胎器官发育的重要指标,但是本研究中作者没有观察到 TDMPP 对出壳有影响,而出壳后测量身长发现,TDMPP 高浓度组对生长具有显著的抑制作用。有研究表明,斑马鱼早期生长迟缓可能与芳香烃受体(AHR)介导的毒副作用相关,这种毒作用是血流减少导致的生长所需的营养物质缺失所引发［9］。

斑马鱼具有和哺乳动物相似的肝脏代谢功能,对外源化合物呈现相近的代谢途径,在72 h pf 发育成全功能性肝脏［10］。本研究首次发现,TDMPP 早期暴露(2～72 h)可显著抑制斑马鱼的肝脏发育,处理组呈现明显的浓度-效应关系,处理组个体的肝脏形态明显处于异常状态。有体外研究表明,TDMPP 具有较强的类雌激素作用,其效力甚至高于知名的外源雌激素双酚A(BPA),可激活 ERα 表达［7］。因此 TDMPP 抑制肝脏发育可能通过雌激素核受体介导,相关内容值得进一步深入研究。在小鼠的研究中表明,TDMPP 具有内分泌干扰物特性,能够直接进入新生小鼠大脑,从而影响与性别相关的脑结构变化,并损伤雌性的生殖功能［6］。

斑马鱼的胰腺发育早期起源于胚胎背侧的内胚层细胞,而位于腹侧的内胚层分化成肝芽,发育成胰腺组织的内胚层细胞分别于24 h pf 在肠道的背部面上形成初级胰岛,随后在胰岛前端,34 h pf 后形成胰管、胰外分泌腺和部分胰内细胞。本研究中发现,胰腺是除肝脏外的另一个主要靶器官,TDMPP 处理72 h pf 能够显著抑制胰腺的发育。相似的研究报道,阻燃剂PFOS 早期暴露会显著斑马鱼胚胎的胰腺长度和面积,干扰脂质代谢相关基因的表达。

综上所述,斑马鱼幼鱼在早期暴露于 TDMPP 后导致发育迟缓、诱导畸形,其主要的毒作用靶器官为肝脏和胰腺,可为TDMPP 的生产、应用和安全性评价提供直接依据。