siApollon 抑制P-gp 逆转白血病细胞耐药机制的研究

孝飞飞 孙洪光 李建厂 朱淑霞 田春梅

多药耐药是化疗失败的最主要原因之一。凋亡抑制蛋白和多药耐药膜转运蛋白P-gp 过度表达是多药耐药的两个主要原因［1］,Apollon 是凋亡抑制蛋白家族主要成员,尤其在复发白血病、诱导无缓解、髓外白血病患者中高表达［2］。本实验通过siRNA 技术沉默562/DNR 细胞中Apollon 基因表达,观察P-gp 表达水平,检测K562/DNR 对化疗药物敏感性的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 将细胞分为实验组(脂质体转染靶向Apollon 的siRNA K562/DNR)、细胞对照组(K562/DNR)和阴性对照组(脂质体转染的siRNAnc)。K562/DNR 细胞株由滨州医学院中心实验室培养；脂质体LipofectamineTM2000 购于美国Invitrogen 公司；兔抗人Apollon 多克隆抗体一抗购于美国Santa Cruz 公司,带有红色荧光标记的四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)二抗购于上海江莱生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐购于美国Sigma 公司；Apollon 及β-actin 引物由上海赛百盛公司合成；靶向Apollon 的siRNA 序列、阴性对照siRNA 序列由上海吉玛公司合成。

1.2 RT-PCR 法 检测ApollonmRNA的表达水平实验组、阴性对照组采用前期稳定转染的细胞接种于6孔板,每组2孔,于24h后提取总RNA,两步法行RT-PCR。Apollon引物序列：Sense 5'-TGGCTCAAGCTGGATTTTAT-3',Anti-sense 5'-TTCAGACCAAGGTTCATCAG-3',扩增长度116bp。内参照β-actin 序 列：Sense 5'-TCATGTTTGAGACCTTCAA-3',Anti-sense 5'-GTCTTTGCGGATGTCCACG-3',扩增片段513 bp。PCR 产物经含EB 的10 g/L 琼脂糖凝胶上电泳,采集、分析图像,计算出目的基因mRNA 的相对表达水平：以Apollon/β-actin 灰度比值(ODR)表示。

1.3 Western Blot 检测P-gp 的表达 收集转染5 d 后细胞,依次加入bufferA、B、C,裂解细胞,离心后收集上清,取等量蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后将蛋白转移到PVDF 膜上,5%脱脂奶粉的TBST 封闭液封闭2 h,经1×TBST 充分漂洗(10 min×3 次),加兔抗人MDR-1 多克隆抗体(稀释度为1∶300),4℃孵育12 h,充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀释度为1∶2400),室温孵育1 h,充分漂洗,化学发光法显色。用α-tublin 做内参重复以上步骤。以P-gp/α-tubulin 比值表示目的基因蛋白的相对表达水平。

1.4 MTT 法检测稳定转染VCR、DNR 耐药细胞株K562/DNR 对化疗药物敏感性的变化 取对数生长期细胞接种于96 孔板。实验分组同前,即分别为K562/DNR/shApollon、K562/DNR/shNC 和K562/DNR。每 组细胞加入不同浓度的VCR 及DNR,VCR 终质量浓度为0、0.01、0.1、1.0、10 和100 μg/ml,DNR 终质量浓度为0、0.15、0.3、0.6、1.2 和2.4 μg/ml,于加药48 h 后加入5 g/L 的MTT 20 μl,检测各孔490 nm 波长处吸光度(A)值,计算各组细胞对VCR、DNR 的细胞增殖抑制率(IR),IR=(1-实验组p 值/细胞对照组A 值)×100%,计算半数抑制浓度(IC50)。

1.5 观察指标 比较三组细胞Apollon mRNA 表达情况、P-gp 糖蛋白表达情况；分析细胞转染前后对VCR、DNR 的敏感性。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t 检验；多组间比较采用Oneway ANOVA 分析；多个均数间两两比较采用q 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞Apollon mRNA 表达情况 实验组Apollon mRNA 的相对表达量为(24.233±0.108)%,低于细胞对照组的(90.031±0.182)%和阴性对照组的(83.686±0.076)%,差异有统计学意义(P＜0.05)；细胞对照组和阴性对照组Apollon mRNA 的相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 P-gp 糖蛋白表达情况 实验组P-gp 糖蛋白表达水平为(78.360±0.517)%,高于细胞对照组的(37.120±0.309)%及阴性对照组的(36.316±0.193),差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 转染前后对VCR、DNR 的敏感性 实验组K562/DNR 的VCR、DNR 的IC50 值明显低于细胞对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；细胞对照组和阴性对照组的IC50 值比较差异无统计学意义(P＞0.05)。实验组未加药、DNR、VCR 的K562/DNR 的凋亡率均显著高于细胞对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；K562/DNR 对化疗药VCR 和DNR 敏感性明显增强。见表1。

表1 各组IC50、凋亡率比较(±s)

表1 各组IC50、凋亡率比较(±s)

注：与实验组比较,aP＜0.05；“-”表示无数据

3 讨论

Apollon 基因高表达肿瘤往往恶性程度高、浸润深,早期即有淋巴结转移、TNM 晚期,该基因阳性者提示预后差［3］。近年来急淋白血病化疗5 年生存率可以达到80%以上,但髓系白血病对化疗的反应不敏感,治疗效果差,90%以上的患者死于不同程度的MDR［4］。有研究称Apollon 基因在细胞凋亡信号通路上是一个关键的基因调控点［5］,本文通过RNAi 沉默K562/DNR细胞中Apollon 基因表达,观察P-gp 表达水平,检测K562/DNR 对化疗药物敏感性的变化,进而探讨Apollon能否成为逆转白血病细胞MDR 的有效靶点。

P-gp 可将化疗药物泵出细胞外,使肿瘤细胞内药物浓度降低,造成细胞MDR,对化疗不敏感或疗效差的肿瘤细胞均高表达P-gp。本实验还运用MTT 法检测实验组K562/DNR 细胞对DNR、VCR 的IC50 明显降低,表明Apollon 基因被抑制后,K562/DNR 对化疗药物敏感性明显增强。进一步证实靶向沉默抑制凋亡基因Apollon 能降低耐药P-gp 糖蛋白表达,提高了耐药细胞株内化疗药物浓度,实验中加用化疗药物的实验组耐药细胞株出现大量死亡,逆转了K562/DNR 细胞的耐药。

综上所述,Apollon 基因高表达与白血病细胞MDR密切相关,抑制Apollon 基因表达后能显著降低耐药P-gp 蛋白表达水平,增强了化疗药物对K562/DNR 细胞增殖的抑制作用,可将Apollon 作为逆转白血病细胞耐药的靶基因,为难治及复发性白血病的治疗提供新思路。