高效液相色谱法测定复方三维右旋泛酸钙糖浆中四种维生素的含量

冯久芳，谢莹霞

1.商丘市食品药品检验检测中心，河南 商丘 476000；2.商丘市第一人民医院药学部，河南 商丘 476001

复方三维右旋泛酸钙糖浆是一种中西药复方制剂，其颜色为红棕色，性状较为稠厚，气味芬芳，口感甜，主要用于儿童营养不良及维生素缺乏症［1-2］。方中含有较多种类的B 族维生素与中药提取物。现行质量标准仅对维生素B1 和维生素B6 进行了质量控制，其他有效成分不能得到有效控制。有研究指出，复方三维右旋泛酸钙糖浆的处方成分较为复杂，是一种由10余种中药提取物混合制成的维生素制剂，同时也由于B 族维生素结构不稳定，且容易受到外界因素影响，易出现降解而影响药物的疗效，因此针对于该制剂中的维生素做更深一步的质量控制是极为重要的。目前国内针对于此类药物的报道多是仅仅针对其中一种或者两种维生素的含量进行测定，或者采用多种方式对于药物中的不同维生素进行测定，处理方式复杂，其检验结果也往往受到多种客观因素的影响，很难对此类药物的维生素含量与质量进行全面的评价［3］。本文采用高效液相色谱法，对制剂中的四种维生素同时测定，方法简便，易于操作，为完善该制剂的质量标准，提供了有利的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），XS205DU型电子分析天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司），KQ400KDE 型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

维生素B1 对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100390-201505，含量为97.0%）、维生素B2 对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100369-201504，含量为98.2%）［2］、维生素B6 对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100116-201404，含量为100%）和烟酰胺对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100115-201604，含量为99.9%）乙腈、甲醇（德国Merek 公司）均为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯，复方三维右旋泛酸钙糖浆（国药控股星鲨制药有限公司，批号：20960901，20960902，20960903，20961001，20960603）。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Betasil C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-5 mmol/L 十二烷基硫酸钠（含0.05% 甲酸）水（B）溶液；流速1.0 mL/min，检测波长260 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL；梯度洗涤时间、流动相比例［3-5］，见表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备：分别取维生素B1、B2、B6 和烟酰胺对照品适量，精密称定，置同一25 mL 量瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制备质量浓度分别为576、116、172 和576 μg/mL的维生素B1、B2、B6 和烟酰胺混合溶液作为对照品溶液［3］。

2.2.2 供试品溶液的制备：精密量取供试品5 mL，置于具塞锥形瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液10 mL，超声处理20 min，将溶液转移至25 mL 量瓶中，加上述溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液［4］。

2.2.3 阴性对照溶液的制备：除维生素B1、B2、B6 和烟酰胺外，其他各药按处方量投料按复方三维右旋泛酸钙糖浆的制备工艺制成阴性对照，然后按供试品的制备方法，制成阴性对照溶液［5］。

2.3 系统适应性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。结果表明四种维生素的峰型良好，分离度达到要求，阴性对照溶液在与对照品主峰的相应位置无干扰。

表1梯度洗涤时间、流动相比例

图1 混合对照品溶液（A）、样品溶液（B）和阴性对照溶液（C）的HPLC色谱图

2.4 线性关系

分别称取维生素B1、B2、B6 和烟酰胺对照品适量，精密称定，置同一25 mL量瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，遵循2.2.1 对照品溶液的制备步骤，制备5.76、11.53、23.05、28.89、57.5、115.2 μg/mL 质量浓度的维生 素B1，1.16、2.33、4.65、5.9、11.5、23.20 μg/mL 质 量 浓 度 的 维 生 素B2，1.72、3.43、6.87、8.5、17.1、34.4 μg/mL 质量浓度的维生素B6，5.76、11.53、23.04、28.7、57.8、115.2 μg/mL 质量浓度的烟酰胺等一系列混合对照品溶液。精密量取对照品系列溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，记录峰面积积分值［6］。以对照品浓度X（μg/mL）为横坐标，峰值面积均值Y 为纵坐标，绘制标准曲线，见表2。结果表明四种维生素的线性关系良好。

表2 4种成分的线性关系曲线

2.5 加样回收率

精密量取一系列混合供试品溶液进行样测定，分别计算各浓度梯度待测成分的加样回收率，见表3。

3 样品测定

5 个批次的复方三维右旋泛酸钙糖浆（精准量取5.0 mL）按照2.2.2供试品溶液的制备步骤制备供试品溶液，分别对样20 μL 的测定峰面积进行记录和含量进行计算，具体数值见表4。

表3 加样回收率研究分析

表4 样品含量测定分析

4 讨论

4.1 色谱柱、测定波长、提取溶剂的选择

本文按照试验方法对维生素B1、B2、B6 和烟酰胺4种维生素含量进行测定，Thermo Betasil C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）通过对C18 的键位进行特殊极性加工，可有效利用各维生素的疏水相互作用、极性相互作用等化学性质差异，准确的分离和高效的保留极性维生素化合物；260 nm检测波长通过影响检测试剂的信号产生及大小，可直接产生各维生素成分含量的色谱图，具有基线稳定，识别度高；0.05%甲酸＋10%甲醇提取溶剂（1:1，pH 3.2）在有效调节溶液酸度的同时，通过较大的极性萃取样品中各维生素成分，且萃取含量极高［7］。

4.2 流动相的优化

按照试验方法对混合供试品溶液和混合对照品溶液的色谱流动相进行分析，发现乙腈-酸水体系在维生素B1、B2、B6 色谱分离中分离度良好，而烟酰胺分离中存在保留时间长、色谱峰拖尾现象严重等问题［8］。因此，可加入适量的甲醇溶液减少色谱分离中各成分的保留时间，抑制拖尾、裂峰现象，改善峰形。

4.3 样品测定结果分析

本文对5 个批次复方三维右旋泛酸钙糖浆进行多次试验方法进行分析，测得样品中维生素B1、B2、B6 和烟酰胺的含量范围分别为0.133 8～0.148 2，0.027 8～0.028 9，0.039 0～0.045 1 和0.138 6～0.143 1 mg/g，分别进行加标回收试验，测得平均回收率取值范围为97.45%～98.42%、97.71%～98.42%、96.69%～98.11%和96.21%～97.99%。

综上所述，本试验采用高效液相色谱法通过色谱柱、测定波长、提取溶剂的选择和流动相的优化，操作简便、精准、重复性佳的完善了临床对复方三维右旋泛酸钙糖浆中四种维生素含量的测定，为该制剂的质控标准，增加了质量控制的科学性。