白花蛇舌草提取物对人肾癌786-O细胞抑制作用及机制的研究

周兴波，刘 岩*

（1.秦皇岛工人医院泌尿外科，河北 秦皇岛 066000；2.锦州医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁 锦州 121000）

肾细胞癌是临床中常见的泌尿系统肿瘤之一，对放、化疗不敏感，手术治疗是早期肾癌最主要的治疗方式，但对晚期肾癌效果不佳，所以探索晚期肾癌的治疗方法是目前较为热门的课题[1]。白花蛇舌草也叫蛇舌癀、鹤舌草，属于茜草科耳草属植物，整株都可作为药材，性寒、微苦，有学者对其进行研究发现其具有免疫调节、杀菌消炎、抗氧化及抗肿瘤等作用[2]，其中最突出的作用是抗肿瘤，特别是对肾癌、直肠癌、胃癌等，但其机制尚不明确，可能与其具有抗氧化性有关[3]。本文通过体外实验探究白花蛇舌草对人肾癌786-0细胞的抑制作用，现总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 材料：白花蛇舌草辽宁省中医药房，提取物（EEHDH）由我院实验室完成。取100g白花蛇舌草，加入20倍剂量的浓度为80%的乙醇，常温下浸泡5小时后在85℃下提取2次，合并滤液，浓缩冷却干燥，得到EEHDH粉，4℃条件储存留作后用。人肾癌786-O细胞购自北京协和细胞所。

1.1.2 主要试剂及仪器：鼠抗人MMP2/MMP9单克隆抗体，TUNEL检测试剂盒，美国BeckmanCoulter流式细胞仪，BG-subMIDI水平电泳仪。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞分析：分别用5个培养板取浓度为5*106/mL的786-O细胞，其中4个分别加入浓度为10、20、40、80mg/L的EEHDH，标号为1、2、3、4，另一只培养板加入等体积培养液作为对照，标号为5，每组设置3个复孔，培养48小时后使用流式细胞仪进行检测。

1.2.2 TUNEL技术：取上述培养48小时后的细胞使用4%浓度的多聚甲醛在室温条件下封闭30min，滴加TUNEL反应液50ul，37℃、湿润条件下孵育1小时，同时另一组滴加POD液50ul，同等条件下孵育半小时作为对照，最后滴加DAB显色液50ul，使用中性树胶封片。

1.2.3 MTT测定：取上述培养48小时后的细胞制成单细胞悬液，分别接种5个培养板上，调整浓度为5*106/mL，培养1天后，分别加入10、20、40、80mg/L的EEHDH，标号为1、2、3、4，另一只培养板加入等体积培养液作为对照，标号为5，每组设置3个复孔，继续培养，分别在24h、48h、72h后加入MTT20ml，继续孵育4小时，过滤掉上清液，每个孔加150ml DMSO，震荡10分钟后测量OD490值[4]。

1.2.4 DNA片段凝胶电泳：取上述培养48小时后的细胞使用PBS清洗2次，加入细胞裂解液2ml混匀，37℃温水浴18小时，再加入NaCl饱和溶液0.8mL继续水浴5分钟，随后以3000r/min的转速离心1小时，取上清液并加入RNA 酶，继续37℃温水浴15分钟，最后用2倍体积的无水乙醇在-20℃条件下沉淀一夜，取2ul进行琼脂凝胶电泳。

1.2.5 Western blot分析：取上述培养48小时后的细胞提取蛋白，取1ul稀释10倍，进行蛋白定量，调整浓度为500ug/ml并-80℃保存。随后进行配胶、点样、电泳、转膜、封闭、结合一抗（鼠抗人β-action），结合二抗，最后进行NBT/BCIP显色5min到30min，当条带呈蓝黑色时用PBS终止反应。

1.3 统计学方法：

将所得数据录入SPSS18.0软件进行整理分析，P＜0.05时有统计学意义。

2 结 果

2.1 对凋亡率的影响：

从表1可以看出，随着EEHDH浓度增加，786-O凋亡率也逐渐增加，各组间对比具有显著统计学意义（P＜0.05）。

表1 不同浓度EEHDH对肾癌786-O凋亡率的影响

2.2 对体外增值的影响：

在细胞培养24h、48h、72h后其OD490值见表2，可以发现随着时间增加及EEHDH浓度增加，OD490值都有所增大，各组间对比差异具有显著性（P＜0.05），特别是浓度为40、80mg/L时，差异更加显著。

表2 不同浓度EEHDH对肾癌786-O的OD490值对比

2.3 琼脂凝胶电泳结果：

发现浓度为40、80 mg/L时，有DNA梯形条带出现，具有细胞凋亡特征性，且随着浓度变大而更加清晰，表明EEHDH能够随机切断786-O细胞的核小体连接DNA，起到抑制细胞增殖的作用。

2.4 Western blot结果：

随着EEHDH浓度增加，蛋白电泳条带的灰度逐渐变低，计算目的条带与参照条带的比值，用以代表蛋白表达水平，显示MMP2及MMP9各组间差异具有明显统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

肾癌是临床泌尿系统中较常见的恶性肿瘤，近年来发病率逐渐上升，早期没有明显临床表现，不易发现，目前治疗手段以手术为主，效果尚可，但对于中晚期肾癌效果较差，且对放化疗不敏感，因此探究中晚期肾癌的治疗方法是当前需要攻克的难题。随着医学发展，有学者发现一些中药材对肿瘤细胞具有抑制作用，能够减缓肿瘤的进展，且不易产生耐药性，安全性较高[5]。白花蛇舌草是一种茜草科耳草属植物，具有较高的抗肿瘤活性，已广泛应用于胃肠道癌、肝癌、肺癌等。Lin等白花蛇舌草提取物对结肠癌细胞的增值具有抑制作用，可诱导肿瘤细胞凋亡。曾永长[6]等使用白花蛇舌草提取物对肝癌HepG2细胞、肺癌A549细胞、直肠癌HCT-116细胞进行体外研究，发现具有明显的抗肿瘤作用。张鹏[7]等证明白花蛇舌草提取物具有抗肿瘤活性。本研究着重于白花蛇舌草提取物对肾癌786-O细胞的抑制作用，发现具有较好效果。

肿瘤的发生与肿瘤细胞的增殖失控和凋亡减少有关，所以抗肿瘤的关键环节在于诱导细胞凋亡及抑制肿瘤细胞增殖[8]。本研究发现，随着EEHDH浓度增加，786-O凋亡率也逐渐增加，各组间对比具有显著统计学意义（P＜0.05），表明白花蛇舌草提取物具有较强的诱导肿瘤细胞凋亡的作用，同时观察了EEHDH对786-O细胞体外增殖的影响，结果发现随着时间增加及EEHDH浓度增加，OD490值都有所增大，各组间对比差异具有显著性（P＜0.05），表明EEHDH对786-O细胞增殖具有明显的抑制作用，且此作用具有时间和浓度依赖性。另外随着EEHDH浓度增加，蛋白电泳条带的灰度逐渐变低，组间比较具有统计学意义（P＜0.05），表明EEHDH能够抑制MMP2及MMP9在786-O细胞内的表达，且呈剂量依赖性。

综上所述，白花蛇舌草提取物具有一定的抗肿瘤作用，能够抑制肾癌786-O细胞的增值，促进其凋亡，具有较高的抗肿瘤价值。