羧甲基壳聚糖-油酸聚合物的载药性能及抗肿瘤活性研究

尤 静，张文涛，苗延青，张雪娇,梁玲玲

(西安医学院药学院，陕西 西安 710021)

羧甲基壳聚糖(CMCS)具有良好的生物相容性、生物降解性及低毒性[1-3]。CMCS作为药物载体可以增强生物大分子药物的透膜能力，提高生物黏附性和生物可降解性，有助于促进生物大分子药物在体内的吸收。同时，CMCS能有效诱导细胞毒性巨噬细胞，也能诱导嗜中性白细胞的积聚，增强药物对肿瘤细胞的靶向性[4-8]。油酸(OA)属于不饱和高级脂肪酸，具有良好的抗肿瘤活性[9-11]。但是油酸口服吸收差，生物利用度低，限制了以其为指标性成分的多种制剂的发展及利用。

CMCS接枝OA得到的两亲性聚合物，可通过自组装方式包载疏水性抗癌药物[12-15]，既能改善疏水性抗癌药物的用药局限，又能协同发挥更好的抗癌效果。鉴于此，作者以自制的羧甲基壳聚糖-油酸聚合物(CMCS-OA)为载体，采用透析法对盐酸阿霉素(DOX)进行包载，初步考察CMCS-OA的载药性能和载药聚合物(DOX-CMCS-OA)的体外释药性能，并通过细胞毒性和细胞摄取实验评价DOX-CMCS-OA的抗肿瘤活性。

1 实验

1.1 试剂与仪器

羧甲基壳聚糖-油酸聚合物(CMCS-OA)，自制；盐酸阿霉素(DOX，98%)、PBS、高糖培养基、胎牛血清、MTT、吖啶橙，上海源叶生物科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺、三乙胺，分析纯。

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义予华仪器有限责任公司；UV-2102C/PC/PCS型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；FD-1型冷冻干燥仪，郑州长城科工贸有限公司；ZEN3600型马尔文激光粒度仪，Malvern Zetamaster UK；1510 Multiskan Go型自动全波长酶标仪，Thermo Fisher Scientific；U-LH100HG IX73型倒置荧光显微镜，Olympus。

1.2 载药聚合物的制备

将6 mg DOX充分溶解于1.6 mLN,N-二甲基甲酰胺及0.4 mL三乙胺中，得到DOX反应液；另取15 mg CMCS-OA充分溶解于15 mL蒸馏水中，置于磁力搅拌器中；室温条件下，将DOX反应液缓慢滴加到CMCS-OA溶液中搅拌反应30 min，待用。

将上述溶液置于截留分子量为8 000～14 000的透析袋中，用pH值为7.4的PBS缓冲液进行搅拌透析，每小时更换一次透析液，12 h后得到载药聚合物(DOX-CMCS-OA)，冷冻干燥保存。

1.3 CMCS-OA的载药性能评价

1.3.1 DOX标准曲线的绘制

精密量取一定体积的0.1 mg·mL-1DOX对照储备液，置于棕色容量瓶中配制成浓度分别为10 μg·mL-1、15 μg·mL-1、20 μg·mL-1、30 μg·mL-1、50 μg·mL-1的系列溶液，测定482 nm处吸光度，以吸光度(A)为纵坐标、浓度(c)为横坐标，绘制DOX的标准曲线。

1.3.2 载药量和包封率的测定

取一定质量DOX-CMCS-OA溶于蒸馏水中，以CMCS-OA溶液为对照，采用分光光度法测定吸光度，按下式计算DOX-CMCS-OA的载药量和包封率：

(1)

(2)

1.4 DOX-CMCS-OA的体外释药性能

取1 mg DOX-CMCS-OA溶于3 mL蒸馏水中，置于透析袋中，两端封口，在20 mL pH值分别为5.0和7.4的PBS缓冲液中进行搅拌透析，温度为37 ℃。于不同时间间隔取出5 mL PBS缓冲液，并补充相应量的新鲜PBS缓冲液，采用分光光度法测定并绘制DOX-CMCS-OA的体外释药动力学曲线。

1.5 DOX-CMCS-OA的抗肿瘤活性

1.5.1 细胞毒性实验

取对数生长期的SGC-7901胃癌细胞和SK-MES-1肺癌细胞，用1640培养基稀释至细胞浓度为5×104个·mL-1，接种于96孔板上，每孔100 μL；置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培养24 h后，分别加入浓度为7.5～60 μg·mL-1的DOX溶液、DOX-CMCS-OA溶液(所含DOX浓度为7.5～60 μg·mL-1)及空白培养液，继续培养24 h，弃去加入的溶液；每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液100 μL，继续培养4 h后，加入二甲基亚砜150 μL，振荡混匀，用酶标仪测定各孔在490 nm处的吸光度，计算细胞抑制率。

1.5.2 细胞摄取实验

取对数生长期的SGC-7901胃癌细胞和SK-MES-1肺癌细胞，用1640培养基稀释至细胞浓度为15×104个·mL-1，接种于6孔板上，每孔2 mL；置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培养24 h后，弃去培养液，分别加入DOX溶液、DOX-CMCS-OA溶液(所含DOX浓度相同)，再分别培养1 h、12 h、24 h后，用PBS缓冲液漂洗3次；加入70%酒精，继续培养30 min，用PBS缓冲液漂洗3次；加入20 μg·mL-1吖啶橙荧光染色剂对细胞核进行荧光染色，培养10 min后，用PBS缓冲液漂洗3次；每孔加入500 mL PBS缓冲液，采用荧光显微镜观察细胞摄取药物的情况。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱分析及DOX的标准曲线(图1)

由图1可知， DOX的最大吸收波长为482 nm，此处CMCS-OA的吸收较小，表明CMCS-OA对DOX的吸光度测定不会造成干扰。对DOX的标准曲线进行拟合，得回归方程为A=0.016c-0.036，相关系数R2=0.995，表明DOX浓度在10～50 μg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好，可以进行定量分析。

图1 CMCS-OA(a)、DOX(b)的紫外光谱及DOX的标准曲线(c)Fig.1 UV spectra of CMCS-OA(a),DOX(b) and standard curve of DOX(c)

2.2 CMCS-OA的载药性能(表1)

由表1可知，当DOX加入量为2.5 mg时，载药量和包封率达到最大，分别为30.28%和65.83%，表明一定质量的CMCS-OA对DOX的自组装包载能力是有限的。

表1 DOX-CMCS-OA对DOX的载药量和包封率

2.3 不同pH值下DOX-CMCS-OA的体外释药性能

载药聚合物注入机体后，药物杀死肿瘤组织需要较高的浓度，这就要求载体能够识别肿瘤组织，在血液循环中防止药物的突释效应，而在肿瘤组织中能够大量释放[6]。由于肿瘤组织细胞的pH值比正常组织细胞低，选取pH值分别为5.0和7.4的PBS缓冲液作为环境介质，不同pH值下DOX-CMCS-OA的体外释药动力学曲线见图2。

图2 不同pH值下DOX-CMCS-OA的体外释药动力学曲线Fig.2 In vitro drug release kinetic curves of DOX-CMCS-OA at different pH values

由图2可知，DOX-CMCS-OA的释药分为3个阶段：(1)由于浓度差导致的初期药物的突释阶段；(2)药物稳定释放阶段，为药物的主要释放阶段，药物从聚合物内部向外部扩散，同时DOX-CMCS-OA逐步降解，这期间药物可以在较长时间内维持稳定的释放速度；(3)当DOX-CMCS-OA降解到一定程度时发生全面分解，从而使药物全面释放。1 660 min时，pH值为5.0和7.4的累积释药率分别为262.29%和232.64%，表明DOX-CMCS-OA在偏酸性环境下的释药效果更好，具有一定的pH值敏感性。

2.4 DOX-CMCS-OA的抗肿瘤活性

2.4.1 细胞毒性实验

DOX、DOX-CMCS-OA对SGC-7901胃癌细胞和SK-MES-1肺癌细胞的抑制率比较如图3所示。

由图3可知，DOX-CMCS-OA对两种癌细胞的毒性均小于药物DOX，但依然具有细胞抑制作用。这是由于，DOX被包载在CMCS-OA载体中，需要一定时间才能释放出来，实际作用于细胞的有效药物浓度低于DOX，导致了较低的细胞毒性。

图3 DOX、DOX-CMCS-OA对SGC-7901胃癌细胞(a)及SK-MES-1肺癌细胞(b)的抑制率比较Fig.3 Comparison of inhibition rates of DOX and DOX-CMCS-OA on SGC-7901 gastric cancer cells(a) and SK-MES-1 lung cancer cells(b)

2.4.2 细胞摄取实验

DOX、DOX-CMCS-OA与 SGC-7901胃癌细胞孵育不同时间的荧光显微镜照片如图4所示。

a,c,e:DOX分别孵育1 h、12 h、24 h

由图4可知，DOX孵育细胞1 h后，DOX的红色荧光与吖啶橙在细胞核位置的绿色荧光几乎重合，证明DOX聚积在细胞核部位，从细胞形态和数量来看，此时细胞仍有一定活力；DOX孵育细胞12 h、24 h后，红色荧光和绿色荧光分布与孵育1 h基本相同，但细胞数量明显减少，形态发生变化，DOX毒性发挥作用，大量细胞凋亡。DOX-CMCS-OA孵育细胞1 h后，红色荧光围绕绿色荧光呈环状，完全不重合，说明DOX被包载在CMCS-OA中，无法快速进入细胞核；DOX-CMCS-OA孵育细胞12 h后，细胞形态和数量较孵育1 h时变化不明显，但细胞核绿色荧光处已有少量红色荧光出现；DOX-CMCS-OA孵育细胞24 h后，红色荧光只有少量仍呈环状，大部分扩散成一团与绿色荧光重叠，此时细胞也出现大量凋亡，说明DOX从CMCS-OA中释放出来，累积到细胞核中，发挥细胞毒性作用。

3 结论

以自制的CMCS-OA为载体，采用透析法对DOX进行包载，DOX-CMCS-OA的载药量和包封率分别达到30.28%和65.83%。体外释药实验表明，DOX-CMCS-OA在 pH值为5.0和7.4下1 660 min时累积释药率分别为262.29%和232.64%，偏酸性环境下释药效果更好，具有一定的pH值敏感性。细胞毒性实验表明，DOX-CMCS-OA 对SGC-7901胃癌细胞和SK-MES-1肺癌细胞均具有较好的抑制作用且比DOX的毒性更低。荧光显微镜观察细胞摄取过程发现，在同一条件下DOX-CMCS-OA进入细胞核的速度比DOX更慢，说明药物有更长效的抑制肿瘤细胞作用。CMCS-OA对DOX的包载能力较好，具有一定的缓释、长效的抗肿瘤作用。