半连续发酵对提高阿维菌素放罐体积的影响

程 曦，刘丽虹，刘进峰，高亚琪

(1.河北兴柏农业科技有限公司 河北省阿维菌素生物技术重点实验室，河北 石家庄 051530；2.石家庄市农业技术推广中心，河北 石家庄 050000)

阿维菌素是阿维链霉菌在含有碳源、氮源、无机盐和微量元素的培养基中通气搅拌、深层发酵产生的具有十六元大环内酯结构的多组分生物杀虫杀螨剂[1]。在其发酵液含有的 8 种组分中，B1a 组分的杀虫效果最佳，是商品化阿维菌素的主要组分[2]。业内将B1a含量作为衡量发酵效价高低的指标。自阿维菌素被发现以来，通过菌种改良、配方及控制工艺的优化，生产水平大幅提高，不过这些措施均以提高发酵效价为目标，关于提高阿维菌素放罐体积的报道却很少。阿维链霉菌作为一种丝状菌，其发酵液总体表现为非牛顿流体性质，并满足剪切稀化特征[3]。在其发酵过程中常有大量泡沫产生，泡沫的存在影响了放罐体积的提高。统计显示，阿维菌素发酵放罐体积约为发酵罐容积的70%，而同为丝状菌的庆大霉素、恩拉霉素发酵放罐体积为发酵罐容积的75%～80%。若采用半连续发酵提高放罐体积，不失为另一种提高阿维菌素发酵产量的途径。

半连续发酵，我国工业界通俗地称其为发酵带放工艺[4-5]，是指在分批培养的基础上，放出部分含有目标产物的发酵液，然后补入相同体积的新鲜培养基继续发酵的方法[6]。在青霉素、头孢菌素工业生产中已成功应用[7-8]；但在其它的以次级代谢产物为目标的发酵带放工艺中应用较少。除了操作复杂、增加工作量及杂菌污染的机会外，更重要的原因是，补入新鲜培养基会稀释生物量；而菌丝的生长有个过程，可能对生产效率有一定程度的影响。阿维链霉菌发酵过程中，液位随培养时间延长逐渐上升，为防止“逃液”常需倒出部分发酵液至其它容器中继续培养或随其它发酵罐带放[9]，在这一过程中,为提高设备利用效率，需将几种不同时期的部分发酵液倒入一台小型容器中混合培养。在对这一现象的长期观察中，发现效价的增长并不因几种不同时期、不同效价发酵液混合而受到影响。以此类推，如果发酵罐带放后补入适当时期发酵液替代传统的新鲜培养基，既可避免生物量的波动，又有利于效价的持续增长。因此，有必要研究补入不同的基质对发酵产量的影响。

鉴于此,作者在100 L、50 L发酵罐中研究阿维链霉菌发酵过程中补入补料培养基和补入发酵液对发酵过程的影响，为阿维菌素工业化生产实施半连续发酵工艺提供理论和数据支持。

1 实验

1.1 菌种与设备

菌种，阿维链霉菌AVS-32，河北省阿维菌素生物技术重点实验室。

20 L种子罐、50 L发酵罐、100 L发酵罐，配备有补料、DO和pH值等自动控制系统和具有数据采集及分析功能的软件系统，镇江东方生物工程设备技术公司。

1.2 培养基与培养条件

1.2.1 种子罐

培养基：淀粉20 g·L-1，黄豆饼粉5 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，花生粉5 g·L-1，氯化钴10 mg·L-1；消后体积为13 L，pH值7.2～7.6。

培养条件：温度28～29 ℃，空气流速1.0～1.2 L·L-1·min-1，搅拌转速200～600 r·min-1，培养时间40～50 h。

1.2.2 发酵罐

培养基：淀粉170 g·L-1，黄豆饼粉27 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，轻质碳酸钙1.5 g·L-1，硫酸铵0.3 g·L-1，淀粉酶质量分数0.025%。接种量8%～10%。

培养条件：温度 27～28 ℃，空气流速0.8～1.2 L·L-1·min-1，搅拌转速400～600 r·min-1，发酵周期320～340 h 。

补料培养基同发酵罐培养基。

1.3 检测方法

1.3.1 生物量测定

准确量取50 mL发酵液置于250 mL三角瓶中，加入适量助滤剂，加热至90～100 ℃， 抽滤，适量水洗，105 ℃下烘干2 h 至恒重(W2)，按式(1)计算生物量(g·L-1)：

生物量=(W2-W0-W1)×20

(1)

式中：W0为滤布质量，g；W1为助滤剂质量，g；20为换算系数。

1.3.2 B1a效价测定

准确量取2 mL发酵液置于50 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声浸提15 min，定容，过滤，进行HPLC分析。色谱柱C18(250 mm×4.6 mm)，流动相 CH3OH-H2O(90∶10，体积比)，流速 1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长246 nm，进样量20 μL。记录峰面积，采用外标法按式(2)计算B1a 效价(g·L-1):

(2)

2 结果与讨论

2.1 B1a 效价和生物量随培养时间的变化趋势

了解阿维菌素发酵过程中效价和生物量的变化趋势，有助于确定不同基质补入工艺的优劣。50 L 发酵罐 B1a 效价、生物量随培养时间的变化趋势见图 1。

图1 B1a效价和生物量随培养时间的变化趋势Fig.1 Change trend of B1a titer and biomass with culture time

由图1可知，发酵前40 h为对数生长期，菌丝快速生长，36 h时生物量相对饱和，生物量达45.6 g·L-1；此后，由于料液的蒸发，发酵液体积减小，生物量仍有所增加，但增速放缓。当发酵进行约50 h时，开始阿维菌素的生物合成，合成速率逐渐加快，100 h后B1a效价呈线性增长。50 L规模发酵过程显示，阿维菌素是阿维链霉菌在菌丝生长繁殖到一定阶段后开始合成的，为典型的次级代谢产物，其发酵过程为非生长偶联型。

2.2 补入不同基质对生物量和B1a效价的影响

补料一般是指发酵进行到产物生成阶段，因合成产物或维持细胞代谢活动的需要，选择性地补充营养物质，使之向着产物积累的方向发展[10]。将100 L发酵罐中培养至237 h的发酵液等分至2台50 L发酵罐中培养，并分别补入体积分数(V补/V混)为15%的补料培养基和培养67 h的发酵液，比较生物量和B1a效价的变化情况，结果见图2。

由图2a可知，补入补料培养基后由于料液的稀释,生物量由50.8 g·L-1下降至46.7 g·L-1，此后较快增长；329 h时生物量达到52.7 g·L-1，与补入发酵液的生物量接近。这是由于，补料培养基为含有碳源、氮源、无机盐和微量元素的复合培养基，造成菌丝一定程度的二次生长繁殖；而补入发酵液后，生物量增加幅度相对较小。

图2 补入不同基质对生物量(a)和B1a效价(b)的影响Fig.2 Effects of adding different matrixes on biomass(a) and B1a titer(b)

由图2b可知，补入补料培养基和发酵液后由于稀释作用，239 h之前B1a效价均大幅下降，此后B1a效价呈线性增长(图3)，并且补入发酵液(斜率K=0.0375)比补入补料培养基(斜率K=0.0346)效价增长快。需要特别注意的是，阿维菌素发酵动力学研究表明，阿维菌素是阿维链霉菌生长繁殖到一定阶段才开始合成的。补料后菌丝的二次生长繁殖并未造成效价增长停滞，而且多次试验均重复了这一现象。可能与菌丝已经具有了次级代谢能力有关；其次，补入的补料培养基对某些有害代谢产物的稀释改善了合成环境，有助于加速阿维菌素的合成，表现出菌丝生长繁殖与产物合成同时进行的混合型发酵特征。由此，可以根据设备配置及实际生产情况，在某些特定情况下的工业化生产，带放后可适时选择补入复合培养基，最大限度地提高生产效率。孙文敬等[6]也研究表明，补料及放料策略的优化是提高产量的关键手段。

图3 B1a效价对培养时间的回归曲线Fig.3 Regression curves of B1a titer and culture time

2.3 补入不同数量的发酵液对B1a效价增长的影响

为了既利用菌丝的次级代谢能力，又能提高发酵液培养设备的利用效率，选择补入培养 50 h 后的发酵液。将100 L发酵罐中培养至240 h的发酵液等分至 A、B 2台 50 L 发酵罐后，分别补入培养58 h发酵液 5 L(体积分数 15%)和 2.5 L(体积分数 8%)，继续培养至336 h，观察B1a效价变化情况，结果见表 1。

由表1可知，由于补入低含量发酵液的稀释作用，242 h B1a效价较240 h均有所下降，而后又快速增长。补入发酵液前后，B1a效价随培养时间变化的回归曲线见图 4。

表1 B1a效价随培养时间的变化

图4 补入发酵液前(a)、后(b)B1a效价对培养时间的回归曲线Fig.4 Regression curves of B1a titer and culture time before(a) and after(b) adding fermentation broth

由图4可知，补入发酵液后回归方程的斜率(罐A0.036 4、罐B 0.029 8)大于补入发酵液前(0.026 6)，且补入发酵液多的A罐大于B罐；即补入发酵液后效价增速更快，且补入的发酵液越多，效价增长就越多，后续试验也重复了这一现象。这是由于补入发酵液，除了补充营养外，还减轻了代谢产物的抑制，保持了菌体活力的稳定，有利于效价的持续快速增长。

由图4b可知，补入低含量发酵液越多，效价增长就越多；但同时对补发酵液前效价的稀释作用也越明显。为准确表达补入发酵液后效价的相对增长情况，为工业化生产确定放罐时间提供理论依据，将试验效价与回归效价进行对比，结果见表2。

表2 试验效价与回归效价对比

由表2可知，尽管补入体积分数15%的发酵液(A罐)，效价增速更快，但由于稀释作用更明显，288 h之前试验效价均低于回归效价，即在此之前不宜放罐；当培养至312 h时试验效价较回归效价高0.018 g·L-1，即宜选择在此之后(补入发酵液72 h后)放罐；补入体积分数8%的发酵液(B罐)，效价增速相对较慢，但由于稀释作用相对不明显，288 h时试验效价较回归效价高0.197 g·L-1，即宜选择在此之后(补入发酵液48 h后)放罐。

2.4 工业化应用探讨

工业化生产以最大限度的提高产能、降低成本为终极目标。如何更高效地使用有限的设备是不容忽视的问题。通常的发酵设备配置，除了大容积发酵罐，还有对应的种子罐及其它小容积发酵罐。三级发酵工艺可以缩短发酵周期增加放罐批次，进而提高大容积发酵罐使用效率；提高小容积发酵罐的使用效率也是提高发酵产能的途径之一。带放工艺由来已久，但用于次级代谢发酵工艺较少，其中，困扰生产人员的主要问题是，带放尽管增加了当时的放罐体积，但随之而来的是带放罐批体积减小的部分怎么补充。首先是补水，在庆大霉素的产物合成与菌体生长同时进行的混合型高密度发酵中有所应用；但阿维菌素发酵液总体表现为非牛顿流体性质，其表观黏度随培养时间的延长而降低，属于拟塑性流体[11]，后期补水显然不利于效价的增长。其次是补料，单纯的补淀粉，意味着碳氮比失衡及总生物量减少，产品得率不高；作者就此研究了在发酵中后期补入补料培养基并与补入发酵液对比，结果显示补入补料培养基劣于补入发酵液。再次是补入发酵液，补入中后期发酵液意味着补入了一定数量的阿维菌素，对效价的稀释作用小但也失去了带放的意义；补入的发酵液培养时间越短，意味着小型发酵设备的利用效率越高，但还应考虑利用菌体的次级代谢能力，所以最优的选择是补入培养50 h后的发酵液。就此研究结果，尝试在单罐容积120 m3发酵罐上应用；将30 m3或12 m3容器作为发酵液培养罐，采用半连续发酵工艺后发酵单罐产量又上新台阶。

3 结论

通过在100 L、50 L发酵罐中进行平行试验，在发酵中后期补入体积分数15%的培养50 h后的发酵液优于补入补料培养基，即发酵罐带放后可选择补入培养50 h后的发酵液替代其它基质。补入体积分数15%的发酵液较补入体积分数8%的发酵液效价增长得更快，但稀释作用也更明显。本研究为阿维菌素工业化生产实施半连续发酵，高效利用小容积发酵罐提供了新思路、新方法。其本质等效于将小容积发酵罐的发酵周期由330 h缩短至50～100 h,即大幅度缩短了发酵周期。半连续发酵是一种重要的生化培养方式，该研究对其它以次级代谢产物为目标产物的半连续发酵的实施具有一定的借鉴价值。