结肠癌组织中miR-520a、RAB22A表达变化及意义

邓晓兰，强金虎，刘靓，朱灵，崔英

无锡市锡山人民医院，江苏无锡214105

结肠癌是常见的肠道上皮源性恶性肿瘤，其发病率较高，且预后不良，严重危害人类生命安全。结肠癌具有起病隐匿和易转移等特点，常导致患者治疗不及时或术后复发，因此，为改善患者预后和提高治疗效率，深入探寻结肠癌致病机制迫在眉睫［1］。微小RNA（miRNA）属于内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物中，通过结合3"非翻译区对细胞增殖和凋亡等生命活动具有重要意义［2］。miR-520a属于miR-520家族，位于19号染色体，主要存在于人类未分化的胚胎干细胞中，能够参与调控干细胞的极性［3］。研究［3］发现，抑制 miR-520a 表达能够使慢性髓细胞样白血病的耐药性增加，间接表明miR-520a起抑癌基因作用。RAB22A 属于Rab 家族，其本质是一种GTP 酶，主要位于具有合成或分泌功能的细胞器内，在运输蛋白和信号转导方面具有重要作用［4］。据相关研究报道［4］，上调的RAB22A 能够改变细胞核形状，使高尔基体和细胞核的信号传递与分子交流受阻，在乳腺癌等多种恶性肿瘤中均起到促癌基因的作用。miR-520a和RAB22A在结肠癌中报道少见，因此本研究观察了结肠癌组织中miR-520a和RAB22A的表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析本院2017 年2 月—2019 年6 月收治的77 例结肠癌患者的临床资料。纳入标准：入选患者均遵循《世界卫生组织肿瘤分类诊断系统》［5］中的标准原则且术后病理显示均为结肠癌；均为首次诊断，且无肠道手术既往史或放化疗史；患者基本信息完整，且自愿接受本次试验。排除标准：合并其他严重肠道疾病或原发恶性肿瘤者；凝血功能异常者；肝肾功能失代偿者；自身免疫系统存在缺陷者。其中男 37 例、女 40 例，年龄（57.13 ±6.39）岁；有淋巴结转移10 例，无淋巴结转移67 例；低分化6例、高分化39例、中分化32例；TNM 分期Ⅰ期 38 例、Ⅱ期 30 例、Ⅲ期 7 例、Ⅳ期 2 例；肿瘤直径≤5 cm 者 47 例，>5 cm 者 30 例。本研究经医院伦理委员会批准，且所有受试者均在知情同意书上签字。

1.2 miR-520a 和RAB22A 检测 采用荧光实时定量PCR 技术。术中分别切取癌组织及其癌旁正常组织（距病灶5 cm 处），经液氮暂存后统一保存于-80 ℃冰箱。各取两种组织30 mg，在冰上研磨均匀后加入1 mL TRIzol 试剂（Invitrogen 公司），遵循相关操作步骤提取总RNA。将提取的10 µg 总RNA 通过PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa 公司）反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒（TaKa⁃Ra 公司）定量检测miR-520a 和RAB22A。miR-520a和 RAB22A 的反应条件均为 42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR 扩增体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 µL、上下游引物均为0.8µL、cDNA template 2µL、dH2O 6µL及荧光显影剂0.4 µL，共计20 µL。上海生工生物公司负责设计所有引物序列。miR-520a 的正向引物序列为5"-GGGGAAAGTGCTTCCCTTT-3"、反向引物序列为5"-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3"，内参基因U6 的正向引物序列为5"-GCTTCGGCAGCA⁃CATATACTAAAAT-3"、反向引物序列为5"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3"；RAB22A 正向引物序列为5"-TTGTAGCCATTGCAGGA-3"、反向引物序列为 5"-AGGCTGTCTTCGGAGTTTGA-3"，内 参 基 因β-actin 正向引物序列为5"-ATGTGCGACGACGAT⁃GTTG-3"、反 向 引 物 序 列 为 5"-CTCGTTG⁃TAGAAGGTGTGG-3"。miR-520a 和 RAB22A 的 PCR反应条件均为 94 ℃ 5 min、变性 94 ℃ 30 s、退火62 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，共扩增40个循环，每个样本均测量 3 次。以 2-ΔΔCt法计算 miR-520a 和 RAB22A的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以-x±s表示，两两比较采用t检验，多组比较采用方差分析；相关性检验应用Pearson 相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织及其癌旁正常组织中miR-520a 和RAB22A 表达比较 结肠癌组织及其癌旁正常组织中miR-520a 的相对表达量分别为0.56 ± 0.22、1.61 ± 0.53，RAB22A 的相对表达量分别为 4.12 ±1.46、1.33±0.54，结肠癌组织中RAB22A的相对表达量较癌旁正常组织升高，而miR-520a 的相对表达量较癌旁正常组织降低（t=15.727，P<0.01；t=16.056，P<0.01）。

2.2 结肠癌组织中miR-520a 和RAB22A 的表达与临床病理参数的关系 结肠癌组织中miR-520a 和RAB22A 的表达与分化程度、淋巴结转移以及TNM分期有关（P均<0.05），而与患者性别、肿瘤直径以及年龄无关（P均>0.05）。见表1。

表1 结肠癌组织中miR-520a和RAB22A的表达与临床病理参数的关系

2.3 结肠癌组织中miR-520a 和RAB22A 表达的相关性 结肠癌组织中miR-520a 的表达和RAB22A的表达呈负相关（r=-0.756，P<0.01）。

3 讨论

结肠癌是危及生命的上皮源性恶性肿瘤，其发病率在发达国家和发展中国家均呈上升趋势。据循证医学统计，每年约有100万例首次诊断为结肠癌，而死于结肠癌患者约50 万例［6］。家族遗传、饮食习惯、地区差异以及基因易感性均可能对结肠癌发病产生不同程度的影响。目前，化疗辅助手术切除仍是治疗结肠癌的首选方式，但常因结肠毗邻器官众多且周围淋巴结和血供丰富，常伴肿瘤复发或转移，因此治疗效果较差［7］。尽管目前临床应用的一些肿瘤指标（如：糖类抗原和癌胚抗原）对诊断结肠癌有一定帮助，但其特异性和敏感度均较低，因此，不断深化探索结肠癌的致病机制对辅助诊断及提高治疗效率至关重要。近年来，分子生物学和基因组学技术不断成熟，人们逐步认识到抑癌基因和原癌基因的异常表达是正常细胞恶变为癌细胞的重要环节。相关研究报道，组蛋白修饰、DNA 甲基化及非编码RNA 均能够参与细胞分裂和分化，从而影响肿瘤的发病及演变［8-9］。

miRNA 是由21～23 核苷酸分子组成的非编码RNA，主要存在于真核细胞中，能够以碱基配对的形式结合3"非翻译区，从而抑制转录产物的后续翻译或直接剪接转录产物，对靶基因的表达具有重要调控作用［10］。miR-520a 在胚胎干细胞中呈高表达，并参与干细胞功能的调控。研究表明，miR-520a 在食管鳞癌中通过抑制ErbB4 基因促进癌细胞凋亡，使其转移和侵袭能力减弱［11］。本研究结果表明，结肠癌组织中miR-520a 表达较癌旁正常组织降低。其原因可能为癌组织中抑癌蛋白表达失活，从而抑制E2F1蛋白，而E2F1是重要的转录因子，其表达下调能导致miR-520a 的启动子沉默，使其转录受阻，最终下调miR-520a 表达［12］。本研究结果表明，结肠癌组织中miR-520a 的表达与分化程度、淋巴结转移以及TNM分期有关，表明miR-520a参与结肠癌致病过程及癌症进展。其机制可能为下调的miR-520a 对PIK3CA 的抑制作用减弱，从而使PIK3CA 表达上调，激活PI3K/AKT 信号通路，缩短G0/G1期，进而促进癌细胞的增殖并增强其迁移和黏附能力［9］。此外，miR-520a 被抑制后，通过调控 STAT3、E2F7 及MAP3K2等基因或信号通路，减少癌细胞凋亡，增强癌细胞的耐药性，使癌细胞的分化和侵袭能力增强［13］。

RAB22A 是由 180～200 个氨基酸组成的 GTP 结合蛋白，主要包括可变的C 端、N 端和稳定的G 结构域，广泛存在于真核细胞的含膜细胞器中，对胞吞作用、囊泡运输、细胞核组装以及形成细胞骨架至关重要［14］。既往研究表明，RAB22A 通过诱导上皮间质转化、调控外泌体分泌以及激活金属蛋白酶使肿瘤细胞的侵袭和迁移增强［15］。本研究结果表明，结肠癌组织中RAB22A的表达较癌旁正常组织升高。其机制可能为具有无限增殖能力的癌细胞中带膜细胞器活性增强，而RAB22A主要存在于含膜细胞器中，因此RAB22A 表达会上调；同时癌组织内早期内体抗原（EEA1）活性增强，而EEA1 能够加速合成RAB22A 的转录翻译过程，从而使RAB22A 表达上调［16］。本研究结果表明，结肠癌组织中RAB22A 的表达与分化程度、淋巴结转移以及TNM 分期有关，表明RAB22A 表达也参与结肠癌的癌变进展过程。研究表明，癌细胞中高表达的RAB22A 能够激活Rab5，从而形成 Rab22-Rabex-5-Rab5 联合体，使表皮生长因子降解，并诱导上皮间质转化，使癌细胞易于侵袭和分化，同时RAB22A 上调能够使癌细胞的代谢能力增强，从而加速癌细胞的分裂和分化［15］。此外，RAB22A 能够促进CD147 的表达，活化相关肿瘤胶原酶并诱导基质金属蛋白酶合成，增强细胞的增殖能力和对细胞外基质的穿透性，最终促进癌细胞的迁移及侵袭。

本研究结果显示，结肠癌组织中miR-520a 表达和RAB22A 表达呈负相关，表明癌组织中miR-520a的下调可能使抑制RAB22A 表达的能力减弱，从而使肿瘤易于形成和进展。尽管目前并无具体机制阐述miR-520a 和RAB22A 相关关系，但是已有研究证明 miR-203、miR-373 以 及 miR-193b 均 能 够 抑 制RAB22A 的表达，从而使肿瘤细胞凋亡及增强药物治疗疗效［16］。此外，RAB22A 和 miR-520a 均可作用于TGF-β信号通路，然而受本次试验设备限制，miR-520a 调控RAB22A 的具体机制尚不清楚，需要日后进一步探索［12，17］。

综上所述，结肠癌组织中RAB22A 表达升高，而miR-520a 表达降低，二者均与肿瘤分化程度、淋巴结转移以及TNM分期有关，共同参与结肠癌进展。