自组装发光定量系统检测胆囊癌患者血清循环游离DNA的水平变化及意义

朱李茹，华影，唐晓磊

1 湖北文理学院附属襄阳中心医院，湖北襄阳441021；2 皖南医学院护理学院；3 皖南医学院第二附属医院

胆囊癌（GBC）是胆道最常见的恶性肿瘤，胆结石是其主要危险因素［1-2］。由于早期缺乏典型的症状及体征，其5 年生存率仅为 5%～10%［3-4］。早期诊断和尽早治疗对改善患者的生存至关重要。健康人循环游离DNA（cfDNA）主要由淋巴细胞和其他有核细胞凋亡后释放入循环，而肿瘤患者体内cfDNA 主要由循环肿瘤细胞和肿瘤坏死裂解或活性释放［5-7］，其水平可能随着疾病的进展而变化，目前已经被报道与疾病的诊断和进展有关。cfDNA 检测可作为一种非侵入性方法来检测患病细胞和组织的遗传物质，对区分癌症患者和健康个人或其他各种非恶性疾病有重要意义。研究报道，多种肿瘤中cfDNA 的水平升高，如肺癌［8］、结肠癌［9］、宫颈癌［10］、卵巢癌［11］，乳腺癌［12］等，但 cfDNA 在 GBC 中的研究较少。目前对cfDNA 的检测多基于qRT-PCR 法，其操作步骤繁琐，耗时较长，易污染，且需要特殊仪器。而本研究设计的富鸟嘌呤（G）单链DNA探针具有特异性识别靶序列及自组装特性双重特性，其富G 序列与血晶素自组装形成的G四联体结构具有过氧化物酶催化活性，本研究利用该结构催化发光底物发光作为检测信号，从而对探针识别的靶序列进行定量检测［13-18］。本研究根据这一技术原理催化发光底物，并结合超敏光检测的灵敏度进行优化，通过对管家基因含量的检测进一步估算cfDNA含量。因此本研究采用这一发光系统对GBC 患者血清中的cfDNA进行检测，并分析其与患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2017 年 2 月—2019 年 2 月湖北省襄阳中心医院肝胆外科收治的83 例GBC 患者（GBC 组）、75 例胆囊炎患者（胆囊炎组），同时选择体检健康者70 例作为对照组。GBC 诊断依据2015年中华医学会外科分会胆道外科学组颁布的《胆囊癌诊断和治疗指南（2015 版）》。排除标准：有其他心肺基础疾病；近期接受过创伤性治疗。GBC 组男42例、女41例，年龄（65.53±17.25）岁，肿瘤分期Ⅱ期 15 例、Ⅲ期 21 例、Ⅳ期 47 例；肿瘤浸润程度：T2、T3、T4分别为 14、26、43 例；局部淋巴结肿大：N0、N1、N2分别为 16、27、40 例；远处转移：M0、M1分别为 29、54 例；有黄疸 52 例。胆囊炎组男 42 例、女 33 例；年龄（62.59 ± 15.34）岁。对照组男35 例、女35 例，年龄（63.61±15.69）岁。三组性别、年龄比较差异无统计学意义。本研究经医院伦理委员会批准，所有受检者签署了书面知情同意书。

1.2 血液样本收集和DNA 提取 收集所有受试者外周血3.5 mL 于促凝真空管中。样本凝固后，30 min内4 ℃ 10 000 r/min 离心15 min分离血清，置于-80 ℃冰箱中储存。使用Serum DNA isolation Kit（Epigentek，USA）按照说明书提取血清中的DNA。

1.3 自组装发光系统构建 选取人特异性β-actin DNA序列作为靶标：5"-ATGCCAACACAGTGCTGTCT⁃GGTGGTACCACCATGTACCCTGGCATT-3"（斜体加粗下划线标记碱基为自组装元件装配预留空间位点）；设计自组装发光系统识别ssDNA 探针，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，探针引物1：5"-TAGGGTTAGGGTTAGGGTCAGCACTGTGTTGGCAT-3"；探针 引物 2：5"-AATGCCAGGGTACATGGTGG⁃TACCACCAGTGGGAT-3"（下划线部分为据所选靶标核酸序列设计的互补序列，斜体加粗序列为自组装发光系统元件），其组装及工作模式如图1 所示。

图1 自组装发光系统模式图

1.4 自组装发光系统对cfDNA 的检测 标准TaqMan人基因组DNA 的浓度为10 ng/µL，以此来制备 DNA 参考浓度 S1～S5，分别为 10、1、0.1、0.01、0.001、0 ng/µL。将设计的带有自组装元件的两条引物（引物按照摩尔数1∶1 混合）以及血晶素（Sigma公司）充分混合后95 ℃加热，缓慢冷却至室温，点样于PVDF 膜（德国默克公司）上晾干，之后均匀喷洒发光底物（美国Lumigen 公司），立即放入化学发光成像仪成像（iBright CL750 型，赛默飞公司），根据光强度值和对应的标准核酸浓度拟合标准曲线。结果显示该系统发光强度与cfDNA浓度对数存在正相关性（R2=0.658 7，P=0.004 4），见图2。随后，从血清中提取的cfDNA 的量通过同样的方法检测发光强度，利用软件拟合量化cfDNA。

1.5 统计学方法 采用SAS8.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料比较用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 三组血清cfDNA 水平比较 对照组、胆囊炎组 、GBC 组血清中 cfDNA 的水平分别为（82.94 ±47.51）、（198.66 ± 103.64）、（1 013.95 ± 681.96）ng/mL，三组间两两相比P均<0.01。

注：A 为自组装发光系统成像图，1～6 分别为 0、0.001、0.01、0.1、1、10 ng/μL 6 个浓度梯度的发光成像，每个浓度做 4 次重复检测；B为光强度及对应标准浓度的相关性分析。

2.2 血清cfDNA 水平与GBC 患者临床病理特征的关系 结果见表1。

3 讨论

本研究利用单链核酸的自组装发光技术检测并评估了GBC 患者血清中cfDNA 的水平。将提取的DNA 与特异性的探针孵育后，利用核酸折叠与血晶素共同形成具有过氧化物酶活性的复合物，从而催化底物发光对核酸总量进行评估［13，19-20］。GBC 早期一般无症状，一般是在晚期通过USG、CT和（或）MRI得以诊断，且与慢性胆囊炎症状较为相似。然而，GBC的诊断和预后没有特异性的肿瘤标志物。肿瘤标志物如肿瘤抗原（CA125、CA19-9、CA242、CA15-3）、癌胚抗原（CEA）等已广泛用于肝癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌的诊断［21-23］。单个的生物标记物通常显示出相互矛盾的结果，而且其特异性较低。因此，有必要找到一个方法在早期阶段诊断GBC。在此次研究中，我们评估了GBC患者血清中cfDNA的水平，并将健康者和胆囊炎患者作为对照进行比较。

研究发现，cfDNA 与各种疾病有着密切的关系。有研究分析，与健康对照相比，cfDNA 水平在其他的恶性肿瘤中是增加的，如在胃癌中高18 倍［24］。本研究表明，GBC 患者血清中cfDNA 的水平约是健康人的14倍，是胆囊炎患者的7倍。且本研究结果表明，GBC 患者血清中cfDNA 的水平与肿瘤分期、TNM 分及黄疸有关。UMETANI 等［25］发现癌症病例中DNA的完整性与肿瘤的大小呈正相关关系，并且还与淋巴—血管侵袭以及淋巴结转移有关。因此通过cfD⁃NA水平实现早癌的检测是一种切实可行的方法［26］。

表1 血清cfDNA水平与GBC患者临床病理特征的关系（±s）

表1 血清cfDNA水平与GBC患者临床病理特征的关系（±s）

临床病理特征年龄（岁）≤60>60性别男 女肿瘤分期Ⅱ、Ⅲ期Ⅳ期浸润程度T2 T3 T4淋巴结肿大N0 N1 N2远处转移M0 M1黄疸无 有n 36 47 42 41 36 47 14 26 43 16 27 43 29 54 31 52 cf DNA（ng/mL）1 258.71±754.65 986.56±494.07 1 276.38±865.99 996.36±519.27 798.45±168.32 1 381.48±776.54 811.48±226.35 985.26±209.35 1 351.47±826.33 664.72±135.67 1 047.64±678.59 1 411.25±944.35 887.31±361.92 1 375.76±859.65 786.33±269.26 1 398.94±952.36 t/F 1.877 1.791 4.996 5.327 5.828 3.62 4.356 P>0.05>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

综上所述，本研究利用游离富G 序列折叠形成G 四联体的特性设计出单链DNA 探针，依据管家基因β-actin 作为标尺，通过发光系统的灵敏度对cfD⁃NA 进行定量，发现GBC 患者血清中cfDNA 水平高，且与肿瘤恶性程度有关。