肝细胞癌组织中miR-548c-3p、TRIM59的表达变化及其意义

熊香芸 ，李茂山 ，彭雁忠

1 深圳市龙华区人民医院，广东深圳518109；2 广州医科大学；3 广州金域医学检验中心有限公司；4 北京大学深圳医院

肝癌是成年人常见的癌症之一，占中国恶性肿瘤发病率的五分之一［1］，2018 年全球新发肝癌病例84 万例，肝癌死亡 78 万例［2］。原发性肝癌中 75%～85%为肝细胞癌（HCC）［1］。导致 HCC 发生的主要病因有乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎的慢性感染，长期大量饮酒及各种原因导致的慢性肝硬化［2］。HCC 易出现肝内、外转移，且术后复发率较高。尽管近期对HCC 分子机制的理解和治疗方法取得了进展，但是目前仍迫切需要新的诊断或预后生物学标志物和治疗靶点。miRNA 是指长度为19～25 个核苷酸的单链RNA 分子，不具有编码蛋白能力［3］。近年来的研究证实，miRNA 在肿瘤的发生发展过程起重要作用。微小RNA 548c-3p（miR-548c-3p）是miR-548c家族中的一员，长度为22个核苷酸。miR-548c-3p 在骨肉瘤［4］、乳腺癌［5］中表达下调，过表达miR-548c-3p 可抑制骨肉瘤、乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。三基序蛋白59（TRIM59）属于三基序家族，该蛋白在卵巢癌、胆管细胞癌等组织和细胞中异常表达［6］。在卵巢癌相关的研究中，WANG 等［6］证实TRIM59 可以通过促进蛋白膜联蛋白A2（ANXA2）的表达从而促进卵巢癌的进展。SHEN等［7］证实，TRIM59 可通过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制胆管细胞癌细胞的增殖能力。已有研究证实miR-548c-3p 可通过调控TRIM59 mRNA 表达促进HCC 细胞增殖和侵袭能力［8］，但仍未有两者在HCC 组织中的表达情况及其与患者临床病理特征及预后关系的研究。本研究分析了HCC 肿瘤组织中 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 的表达及意义，以期为寻找新的HCC 诊治及预后的分子标志物提供方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2013 年1 月—2015 年1 月于深圳市龙华区人民医院诊治的114例行手术治疗的HCC 患者的临床病理资料。纳入标准：经术后病理学检查确诊为HCC；初次发现，既往未接受过放化疗等抗肿瘤治疗；患者或其家属均签署知情同意书，术后病理及随访资料完整无缺。排除标准：既往患有其他恶性肿瘤；合并严重心肝肾等脏器功能不全；合并感染性疾病、自身免疫性疾病等。其中男75例，女39例；年龄23～78（60.1 ± 3.3）岁；肿瘤直径≤5 cm者47例，>5 cm者67例；淋巴结转移者49例；伴乙肝感染者56 例；伴肝硬化者43 例；肿瘤TNM 分期：Ⅰ期 39 例，Ⅱ期 40 例，Ⅲ期 35 例；分化程度：高分化32，中分化43 例，低分化39 例。以患者出院日为随访起始时间，利用电话随访，结合患者复查病历。随访截止于2020 年1 月，随访间隔时间1个月。随访内容为随访期间患者生存情况。

1.2 组织中 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。收集术中切除的新鲜HCC 组织和距离4 cm 以上癌旁组织，经快速液氮冷冻运输，于-80 ℃深低温冰箱保存。将50 mg组织冰上研磨后按照TRIzol 说明书，提取组织RNA。按照逆转录试剂盒说明合成cDNA，采用分光光度计鉴定cDNA纯度，使A260/A280在1.8～2.0，置于-20 ℃冰箱储存。TRIzol 试剂及逆转录试剂盒均购于Invitrogen公司。PCR 纯化试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM购于TaKaRa公司。miR-548c-3p上游引物序列：5"-TGGT⁃GTCGTGGAGTCG-3"，下 游 引 物 序 列 ：5"-GGTG⁃CATTGTAGTTGCA-3"；TRIM59 mRNA 上游引物序列：5"-CTTCCGCCACTTGCCAATG-3"，下游引物序列：5"-TGGATCTCCCCTACTCGGTG-3"；内参基因 U6 上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGA-3′；GAPDH 上游引物序列：5"-GAAGGTGAAGGTCGGAGTTC-3"，下游引物序列：5"-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3"。 反 应 体 系 ：SYBR mix 2.5µL、上游引物（10µmol/mL）0.1µL、下游引物（10 µmol/mL）0.1 µL、cDNA 1.00 µL、去核糖核酸酶水 1.3 µL。反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，42 个循环。以 2-ΔΔCt法计算 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 的相对表达量。每个实验均重复3次以上。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料以±s表示，两组比较采用两独立样本t检验；采用Pearson 相关性分析分析miR-548c-3p 与TRIM59的关系；采用Kaplan-Meier法分析不同miR-548c-3p、TRIM59 表达患者的生存差异。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织与癌旁组织中miR-548c-3p、TRIM59表达比较 miR-548c-3p 在HCC 组织、癌旁组织中的 相 对 表 达 量 分 别 为 0.503 ± 0.141、0.890 ±0.076，两者相比差异有统计学意义（t=25.796，P<0.05）。TRIM59 mRNA 在 HCC 组织、癌旁组织中的相对表达量分别为2.893 ± 0.329、1.203 ± 0.226，两者相比差异有统计学意义（t=45.207，P<0.05）。Pearson 相关分析结果提示，HCC 组织中miR-548c-3p 表达与TRIM59 mRNA 表达呈负相关（r=-0.735，P<0.05）。

2.2 HCC 组织中 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 的表达与患者临床病理特征的关系 HCC 组织中miR-548c-3p 及 TRIM59 mRNA 表达与 TNM 分期、淋巴结转移和分化程度有关（P均<0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤直径、是否患有乙肝及是否存在肝硬化无关（P均>0.05）。见表1。

表1 HCC组织中miR-548c-3p、TRIM59 mRNA表达与患者临床病理特征的关系（±s）

表1 HCC组织中miR-548c-3p、TRIM59 mRNA表达与患者临床病理特征的关系（±s）

临床病理参数年龄<60岁≥60岁性别男 女肿瘤直径≤5 cm>5 cm乙肝有 无淋巴结转移有 无肝硬化有 无TNM分期Ι、Ⅱ期Ⅲ期分化程度高中分化低分化n 59 55 75 39 47 67 56 58 49 65 43 71 79 35 75 39 miR-548c-3p相对表达量（-x±s）0.512±0.140 0.493±0.172 0.525±0.139 0.483±0.143 0.494±0.145 0.506±0.134 0.517±0.146 0.492±0.141 0.107±0.148 1.028±0.132 0.471±0.148 0.506±0.165 0.535±0.146 0.431±0.132 0.551±0.166 0.411±0.113 t 0.649 1.516 0.455 0.930 35.002 1.140 3.610 4.724 P>0.05>0.05>0.05>0.05<0.01>0.05<0.01<0.01 TRIM59 mRNA相对表达量（-x±s）2.944±0.353 2.838±0.363 2.703±0.345 2.645±0.324 2.833±0.322 2.935±0.353 2.937±0.326 3.043±0.339 4.146±0.319 1.231±0.309 3.065±0.314 2.989±0.323 1.978±0.298 4.961±0.319 1.953±0.293 4.701±0.387 t 1.580 0.869 1.574 1.701 49.175 1.230 48.242 42.447 P>0.05>0.05>0.05>0.05<0.01>0.05<0.01<0.01

2.3 HCC 组织中 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 表达与患者生存预后的关系 本研究114 例HCC 患者中，随访2～60（38.2 ± 6.3）月，随访期间死亡79例，无失访病例。以HCC 组织中miR-548c-3p mRNA 相对表达量均数0.503为临界值，分为高表达56例、低表达 58 例。高 miR-548c-3p 表达者随访4～60 月，5年总体生存率（OS）为42.86%（24/56），生存时间为（38.5±6.7）月。低miR-548c-3p 表达者随访2～60月，5 年OS 为18.97%（11/58），生存时间为（29.1 ±5.9）月。Kaplan-Meier 分析（Log-rank 检验）表明，低miR-548c-3p 表 达 者 5 年 OS 低于高 miR-548c-3p 表达者（χ2=7.644，P<0.05）。低 miR-548c-3p 表达者生存时间低于高miR-548c-3p 表达者（t=7.957，P<0.05）。见图1。

TRIM59 mRNA 相对表达量以均数2.893 为临界值，分为高表达55 例和低表达59 例。低TRIM59表达者随访3～60 月，5 年OS 为 42.37%（25/59），生存时间为（42.1±6.2）月。高TRIM59 表达者随访2～60 月，5 年 OS 为 18.18%（10/55），生存时间为（31.1± 5.9）月。Kaplan-Meier 分析（Log-rank 检验）表明，低TRIM59表达者5年OS高于高TRIM59表达者（χ2=7.830，P<0.05），低TRIM59 表达者生存时间高 于 高 TRIM59 表 达 者（t=9.689，P<0.05）。见图2。

3 讨论

肝癌是我国成人最常见的癌症之一，已经成为我国恶性肿瘤致死的重要因素之一［1-2］。肝癌转移率高，术后复发率高。早期的肝癌因缺乏临床症状，原发性肝癌在确诊时，多数已处于中、晚期，可接受手术治疗的患者为5%～10%［1］。尽管现在对HCC 的治疗手段有所进展，如肝切除术、肝移植术、肝动脉栓塞化疗等，但肝癌的5 年中位生存率仍保持在50%左右（17%～69%）［2］。到目前为止，关于肝癌转移和复发的分子生物学机制仍然处于探索阶段，因此探索肝癌进展过程的分子机制，合理利用生物标记物以评估复发和转移的风险，将为进一步的治疗提供方向和依据。

图1 HCC组织中miR-548c-3p表达与患者生存预后的关系

图2 HCC组织中TRIM59 mRNA表达与患者生存预后的关系

miRNA 是一种非编码RNA，参与转录后调控下游基因的表达。miRNA 通过特异性结合靶基因mRNA 的3"非编码区来调控下游多种基因的表达。miRNA 的表达和功能失常与炎症、免疫及肿瘤等有关。研究表明，肿瘤中miRNA 异常表达影响肿瘤的增殖、迁移及浸润等生物学行为，有可能成为肿瘤诊断、治疗及随访的分子标志物［3］。miR-548家族最早发现可与多种病毒密切结合，如乙肝病毒、丙肝病毒和人类免疫缺陷病毒等，随后的研究证实miR-548与多种肿瘤均有关系。近年来多项研究发现，miR-548c-3p可参与调节多种肿瘤的发生发展过程，通过调控下游不同基因的表达，发挥抑癌基因的作用［9］。例如miR-548c-3p 可通过抑制人低氧诱导因子1α（HIF-1α）介导的血管内皮生长因子（VEGF）信号通路抑制甲状腺癌的进展［10］。本研究中，HCC 组织中miR-548c-3p的相对表达量显著低于癌旁组织，其机制可能与调控miR-548c-3p 基因表达的长链非编码RNA 表达异常有关。研究表明，长链非编码RNA HIF1A-AS2 能够作为分子海绵结合并抑制miR-548c-3p 的表达，激活 HIF-1α/VEGF 途径，促进肿瘤细胞增殖、浸润等恶性生物学行为［11］。另外，本研究结合患者的临床病理特征数据发现HCC 组织中miR-548c-3p 的表达与TNM 分期、淋巴结转移和分化程度有关，表明miR-548c-3p 参与促进肝癌的恶性进展。分析其原因，可能是miR-548c-3p 的表达下调激活VEGF的表达，VEGF能够促进肿瘤的血管及淋巴管生成能力，导致肿瘤细胞通过血管或淋巴管发生转移。此外，miR-548c-3p表达降低促进上皮间质转化过程中的间质性表型的表达增加，如N-钙黏素及波形蛋白的表达增加，促进肿瘤的恶性分化，导致肿瘤分化程度降低及分级增加［12］。Kaplan-Meier分析发现低miR-548c-3p 表达者5 年OS 低于高miR-548c-3p 表达者，进一步证明miR-548c-3p 的低表达可能与患者的预后不良相关，可作为HCC 患者不良预后的生物学标志。

TRIM 家族大多都拥有E3 泛素化连接酶活性，TRIM59 是TRIM 家族成员之一，其编码基因位于3号染色体上，编码的蛋白全长403个氨基酸，可通过调节p53 抑癌基因和AMP 依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路及原癌基因的转录激活，在肿瘤细胞代谢、增殖、转移方面发挥重要作用［13-14］。本研究中，HCC组织中TRIM59 的mRNA 表达高于癌旁组织，其机制可能是，肿瘤微环境中转化生长因子β 通过激活下游Smad2/3 信号的传导，导致下游TRIM59 基因表达增加［15］。癌组织中TRIM59 mRNA 的表达与TNM分期、淋巴结转移和分化程度有关，说明TRIM59 参与癌变进展。TRIM59 参与调节p53 和AMPK 的信号转导能力，TRIM59 的表达上调可激活p53 和AMPK 信号通路，同时还可以促进原癌基因的激活，即从多途径调节肿瘤细胞的增殖及转移能力。CHEN 等［16］发 现 TRIM59 的表达可 激 活 Wnt/betacatenin 经典通路，促进肿瘤上皮间质转化相关基因的表达，降低肿瘤分化程度，同时增强肿瘤细胞的增殖及转移能力，使肿瘤易发生转移。Kaplan-Meier分析发现高TRIM59 表达者5 年OS 低于低TRIM59表达者，结果提示TRIM59 可作为判断HCC 预后的标志物。

Pearson 相关分析发现，HCC 组织中miR-548c-3p 与TRIM59 表达呈负相关，这可能是因为TRIM59是miR-548c-3p 的下游调控元件，即miR-548c-3p 可抑制TRIM59 的表达，从而抑制p53/AMPK 轴的促癌效应［8］。当癌组织 miR-548c-3p 的表达降低时，miR-548c-3p 无法促进 TRIM59 泛素化并导致 TRIM59 的降解能力下降，因此TRIM59 促进HCC 细胞的促增殖及迁移能力。

综上所述，HCC 组织中miR-548c-3p 表达降低，TRIM59 mRNA 表达升高，两者表达呈负相关，且miR-548c-3p、TRIM59 mRNA的表达与TNM分期、淋巴结转移、分化程度和预后密切相关，二者有可能成为新的HCC诊治及预后的分子标志物。