买麻藤下调LINC00673 表达对肝癌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响

方健，王辰男，孟庆刚

北京中医药大学，北京100029

肝癌是全球范围内与癌症相关死亡的重要原因之一。2018年，我国报告的肝癌新增病例超过39万例［1］。肝癌的治疗方法包括手术切除、放疗、肝移植和化学治疗［2］。手术切除是治疗肝癌的最常见方法，但术后仍存在复发。因此，需要详细了解肝癌的机制，以制定有效的治疗策略。买麻藤系买麻藤科植物买麻藤或小叶买麻藤的干燥藤茎，是一种具有抗肿瘤、抗氧化作用的中草药［3］，其乙醇提取物对肝癌BEL-7402 细胞和白血病HL-60 细胞的生长具有良好的抑制作用［4］。然而买麻藤在肝癌中的作用研究较少。长链非编码RNA（lncRNA）为长度超过200 nt的非编码RNA［5］。研究表明，lncRNA与肝癌的发生发展有关［6］，其中包括LINC00673。LINC00673 已成为癌症发展和进展的重要调节剂，可以促进上皮性卵巢癌的增殖和转移［7］。LINC00673在肝癌癌组织和细胞系中高表达，与预后差和生存率低有关。且LINC00673的沉默抑制肝癌细胞的体外增殖、侵袭和上皮—间质转化［8］。但LINC00673 是否参与买麻藤调节肝癌细胞的增殖转移和细胞周期过程，目前仍未可知。2019年5月—2020年6月，本研究旨在探讨买麻藤对肝癌细胞增殖、迁移和周期的影响，并通过LINC00673进一步探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞Huh-7 购自美国模式菌种收集中心，胎牛血清（FBS）、Dulbecco 改良的Eagle 培养基（DMEM 培养基）、磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Gibco 公司，LINC00673 过表达质粒 pcDNALINC00673、过表达空载质粒pcDNA 购自上海Ge⁃nePharma 公司，噻唑蓝（MTT）购自Sigma-Aldrich 公司，SYBR Green PCR 试剂盒购自大连TaKaRa 公司，双辛可宁酸（BCA ™）蛋白测定试剂盒购自美国Pierce 公司，细胞核相关抗原 Ki-67 抗体、E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体、N-钙黏蛋白（N-cadherin）抗体、辣根过氧化物酶缀合的IgG 二抗购自上海Abcam 公司。买麻藤提取物参照姚柳利等［4］的报道制备，即取买麻藤药材粉末（200 g），以1∶10 的料液比加入70%乙醇，回流提取2 h，重复3 次，合并滤液减压浓缩成膏状，之后用蒸馏水作溶剂，乙酸乙酯萃取，合并6 次的滤液，浓缩至浸膏，经聚酰胺柱色谱分离，真空冷冻干燥，得到深褐色粉末状物。实验时，采用DMEM 培养基将买麻藤稀释成所需浓度20、40、60 ng/mL。

1.2 细胞培养与实验分组 将Huh-7 细胞与含10% FBS 的 DMEM 培养基一起孵育，在 37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。实验分组：将Huh-7细胞分为对照组、买麻藤低剂量组、买麻藤中剂量组、买麻藤高剂量组、买麻藤高剂量+pcDNA 组、买麻藤高剂量+pcDNA-LINC00673 组共6 组。其中，对照组Huh-7 细胞未处理，买麻藤低、中、高剂量组分别以20、40、60 ng/mL 买麻藤作用 48 h。买麻藤高剂量+pcDNA 组、买麻藤高剂量+pcDNA-LINC00673 组细胞以每孔3×105个的密度接种在6 孔板中，并在DMEM 完全培养基中生长24 h，直到融合率达到80%～90%，之后将Huh-7 细胞用新鲜培养基冲洗，并 分 别 与 pcDNA、pcDNA-LINC00673 和 Lipo⁃fectamine2000孵育4～6 h，将转染培养基更换为新鲜培养基，并以60 ng/mL买麻藤处理48 h。

1.3 细胞存活率测算 采用MTT 法。各组Huh-7细胞处理结束后，将其接种于96 孔中，每孔2×104个细胞，48 h 后，将MTT（终浓度为5 mg/mL）添加到每孔中，并孵育2 h。去除培养基，使用100µL 二甲基亚砜（DMSO）溶解深蓝色的甲瓒沉淀，并使用酶标仪在490 nm 处评估Huh-7细胞的光密度（OD）值，计算细胞存活率（%）。存活率（%）=实验OD 值/对照OD值×100%。

1.4 细胞克隆形成检测 在克隆形成测定中，将各组Huh-7 细胞以每孔600 个细胞的密度接种在6 孔板中。经过14 d 左右，用甲醇固定并用结晶紫染色直至细胞克隆可见。计算形成克隆的细胞数。

1.5 细胞周期检测 采用流式细胞术。收集各组Huh-7细胞1×105个，用70%乙醇固定，4 ℃过夜。然后将Huh-7 细胞与含10 µL RNase A 的碘化丙啶工作液孵育，37 ℃保持30 min。之后通过流式细胞仪在488/575 nm 激发/发射波长下检测细胞周期，并通过 FlowJ 软件分析数据，得出 G0+G1、S、G2+M 期细胞比例。

1.6 细胞中LINC00673 表达检测 采用实时荧光定量PCR。用TRIzol 试剂提取各组Huh-7 细胞的总RNA，通过OD260/OD280值确定提取的RNA 的浓度和质量。使用逆转录试剂盒合成cDNA，定量SYBR Green PCR 试剂盒进行PCR。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作内部参考。LINC00673 引物：正向序列为 5"-AATATTAAACGGTCCAGTCCTACAA-3"，反向序列为5"-TAGGACTGCCCATTACAGAGGA-3"。GAPDH 引物：正向序列为5"-CGACTTATACATG⁃GCCTTA-3"，反向序列为 5"-TTCCGATCACTGTTG⁃GAAT-3"。采 用 2-ΔΔCt法 计算 LINC00673 的相 对 表达量。

1.7 细胞迁移检测 采用Transwell 法。收集各组Huh-7 细胞。在迁移实验中，将包含1×105个Huh-7细胞的500 µL 无血清DMEM 培养基加入Transwell设备的上腔室。接下来，将 700 µL 含 10% FBS 的DMEM 培养基加入下腔室。24 h 后，将膜下侧的Huh-7细胞染色，并在显微镜下高倍视野中计数。

1.8 细胞中 Ki-67、E-cadherin、N-cadherin 蛋白检测 采用Western blotting 法。各组Huh-7 细胞处理结束后，用PBS冲洗，并在RIPA裂解缓冲液（包括蛋白酶抑制剂）中裂解。使用BCA™蛋白测定试剂盒对获得的总蛋白浓度进行定量。通过十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后，将膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，然后与抗Ki-67、E-cad⁃herin、N-cadherin 和GAPDH 的一抗一起孵育，4 ℃过夜。一抗均以1∶1 000的稀释度稀释。洗涤膜，在室温下用辣根过氧化物酶缀合的IgG 二抗（1∶5 000 稀释度稀释）在室温下放置1 h。随后，用Bio-Rad 的Image Lab™软件捕获蛋白条带的信号。以GAPDH为对照，分析Ki-67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以-x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Huh-7细胞增殖情况比较 结果见表1。

2.2 各组细胞周期比较 结果见表2。

表1 各组细胞存活率和克隆形成数比较（±s）

表1 各组细胞存活率和克隆形成数比较（±s）

注：与对照组相比，aP<0.05；与买麻藤低剂量组相比，bP<0.05；与买麻藤中剂量组相比，cP<0.05；与买麻藤高剂量组相比，dP<0.05；与买麻藤高剂量+pcDNA组相比，eP<0.05。

组别对照组买麻藤低剂量组买麻藤中剂量组买麻藤高剂量组买麻藤高剂量+pcDNA组买麻藤高剂量+pcDNA-LINC00673组F P存活率（%）98.16±1.15 85.45±0.98a 71.46±0.84ab 54.86±0.86abc 54.79±0.89abc 90.91±1.15abcde 1 059.802<0.01克隆形成数（个）118.33±2.05 98.00±1.63a 69.33±1.25ab 52.67±1.25abc 53.33±1.25abc 107.00±1.63abcde 1 022.994<0.01

表2 各组细胞周期分布比较（%，±s）

表2 各组细胞周期分布比较（%，±s）

注：与对照组相比，aP<0.05；与买麻藤低剂量组相比，bP<0.05；与买麻藤中剂量组相比，cP<0.05；与买麻藤高剂量组相比，dP<0.05；与买麻藤高剂量+pcDNA组相比，eP<0.05。

组别对照组买麻藤低剂量组买麻藤中剂量组买麻藤高剂量组买麻藤高剂量+pcDNA组买麻藤高剂量+pcDNA-LINC00673组F P G0+G1期33.27±0.26 36.44±0.35a 40.62±0.52ab 44.13±0.46abc 44.17±0.45abc 33.64±0.37bcde 438.789<0.01 S期33.79±0.35 30.44±0.31a 26.22±0.33ab 22.79±0.26abc 22.85±0.26abc 32.10±0.36abcde 687.523<0.01 G2+M期32.94±0.29 33.12±0.33 33.16±0.46 33.08±0.43 32.98±0.17 33.27±0.39 0.341>0.05

2.3 各组细胞迁移情况比较 对照组、买麻藤低剂量组、买麻藤中剂量组、买麻藤高剂量组、买麻藤高剂量+pcDNA 组、买麻藤高剂量+pcDNA-LINC00673组迁移细胞数分别为（165.00 ± 2.45）、（135.33 ±2.05）、（100.33 ± 1.25）、（74.67 ± 0.94）、（75.33 ±1.25）、（146.00 ± 1.41）个，除买麻藤高剂量组与买麻藤高剂量+pcDNA 组相比无统计学差异外，各组两两相比P均<0.05。

2.4 各组细胞中LINC00673表达比较 对照组、买麻藤低剂量组、买麻藤中剂量组、买麻藤高剂量组、买麻藤高剂量+pcDNA 组、买麻藤高剂量+pcDNALINC00673 组中LINC00673 的相对表达量分别为1.00 ± 0.03、0.78 ± 0.02、0.60 ± 0.02、0.31 ±0.01、0.31± 0.01、0.84± 0.02，除买麻藤高剂量组与买麻藤高剂量+pcDNA 组相比无统计学差异外，各组两两相比P均<0.05。

2.5 各组细胞中Ki-67、N-cadherin、E-cadherin 蛋白表达比较 见表3。

表3 各组细胞中Ki-67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达比较（±s）

表3 各组细胞中Ki-67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达比较（±s）

注：与对照组相比，aP<0.05；与买麻藤低剂量组相比，bP<0.05；与买麻藤中剂量组相比，cP<0.05；与买麻藤高剂量组相比，dP<0.05；与买麻藤高剂量+pcDNA组相比，eP<0.05。

组别对照组买麻藤低剂量组买麻藤中剂量组买麻藤高剂量组买麻藤高剂量+pcDNA组买麻藤高剂量+pcDNA-LINC00673组F P Ki-67蛋白0.75±0.03 0.58±0.02a 0.40±0.02ab 0.24±0.01abc 0.23±0.01abc 0.66±0.02abcde 378.365<0.01 E-cadherin蛋白0.18±0.01 0.32±0.02a 0.52±0.03ab 0.72±0.03abc 0.72±0.02abc 0.24±0.01abcde 365.914<0.01 N-cadherin蛋白0.63±0.03 0.48±0.02a 0.29±0.02ab 0.15±0.01abc 0.14±0.01abc 0.54±0.02abcde 338.530<0.01

3 讨论

肝癌作为高发恶性肿瘤，严重威胁人类的健康［9］。肝癌的发生与乙型和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素、乙醇、肝硬化等有关［10］。但是，肝癌的发病机制仍不清楚。因此，研究肝癌发生的调控机制有助于开发新的治疗方法。本研究观察了买麻藤对人肝癌Huh-7 细胞增殖、迁移的影响。既往研究表明，买麻藤应用于抑制肝癌细胞的潜在路径可能依赖买麻藤提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用［11］。买麻藤提取物对肝癌细胞具有显著的抑制效果，表明了买麻藤的抗肝癌活性。然而，买麻藤在肝癌中的具体作用仍有待确定。与报道［3-4］相符，本研究进一步证明了买麻藤在肝癌中的作用，即20、40、60 ng/mL的买麻藤显著降低了肝癌Huh-7 细胞的增殖、克隆形成能力和迁移能力，并导致细胞周期阻滞于G0+G1期，同时增殖、迁移相关蛋白 Ki-67、N-cadherin 和E-cadherin 的表达也受到显著影响。重要的是，上述作用效果随买麻藤浓度的增加而逐渐显著，表明了买麻藤对肝癌肿瘤的抑制活性。

本研究还探讨了买麻藤影响肝癌细胞增殖、迁移和周期的可能机制。发现20、40、60 ng/mL的买麻藤能够显著降低Huh-7 细胞中的LINC00673，且LINC00673 的表达随买麻藤浓度的增加而降低，提示LINC00673 介导买麻藤的肝癌抑制作用。LINC00673 是位于染色体 17q24.3 上的 lncRNA 编码基因，也是多种癌症中的重要致癌基因［12］，已被确定与肝肿瘤的进展有关［13］。根据报道，LINC00673在神经胶质瘤细胞中高表达，LINC00673 沉默抑制神经胶质瘤U87MG 和U118MG 细胞的迁移和侵袭［14］。LINC00673 在乳腺癌组织中显著上调，通过调节B7-H6和上皮—间质转化促进乳腺癌的增殖和转移［15］。LINC00673 通过 Kruppel 样因子 2 诱导甲状腺癌的增殖、转移和上皮—间质转化［16］。由此可见，LINC00673 起着癌基因的作用，促进肝癌［8］等癌症的发生和发展。本实验中，LINC00673过表达后，买麻藤抑制肝癌Huh-7细胞增殖、克隆形成、迁移、S期细胞比例、Ki-67、N-cadherin 表达的作用被逆转，其促进G0+G1期细胞比例、E-cadherin 表达的作用同样被逆转。说明买麻藤抗肝癌增殖和迁移的作用机制与下调LINC00673表达有关。

综上可见，买麻藤通过下调LINC00673的表达，抑制肝癌细胞增殖、迁移，并阻滞细胞周期，这为临床实践中肝癌的治疗提供了潜在的选择。