ELISA法检测HIV抗体的影响因素

王俊瑶，周玉梅，李妍妍

(1.郑州市第三人民医院 检验科，河南 郑州 450000；2.郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院 呼吸科一病区，河南 郑州 450018)

近年来，艾滋病感染率有所上升，临床防治形势严峻，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)抗体检测显得尤为重要。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是检测各种抗体、抗原的常用方法，具有特异性强、敏感度高、可重复性等优势，且试剂较为稳定，操作方便，适用于大规模筛查[1]。但ELISA检测结果受多种因素影响，如何避免影响因素干扰以提高临床诊断准确率，是临床研究重点关注方向。基于此，本研究探讨ELISA法检测HIV抗体的影响因素。

1 资料与方法

1.1 标本来源收集郑州市第三人民医院2017年10月至2019年10月接受HIV抗体筛查的3 144例血液标本进行检测，其中初诊疑似HIV阳性标本11例，经确认HIV阳性4例。

1.2 试剂(1)选择：选择特异度、敏感度较好、经国家食品药品监督管理局注册批准的试剂，若更换试剂批号则需进行平行试验，严格在有效期内使用。(2)预处理：检测前将试剂盒与室温下放置20～30 min，尽量与室温保持一致。(3)内部对照：进行试剂盒所提供阴性、阳性血清对照，内部对照无效则需再次检测；注意内部对照仅限于同批号。(4)本研究所用试剂分别为：武汉生物制品研究所有限责任公司，国药准字S19991013；河南华美生物工程有限公司，国药准字S20010066。

1.3 温度(1)于恒温箱内放置温度计，避免实际温度与恒温箱显示温度存在差异。(2)预先评估不同季节微孔板从室温拿到温箱后孔内温度达到37 ℃所用时间，确保设定温度下反应时间充足，将温度计置于微孔板溶液进行观察。(3)本研究所用温度计均经相关部门检测合格。

1.4 其他因素(1)加样操作时注意勿出现气泡，勿触及孔壁，加样完成后混匀，覆膜。(2)反应板浸泡时间、洗涤次数可对检测结果造成影响，一般每次浸泡50 s，洗涤5～6次。(3)检测标本吸光度前进行酶标仪预热，时间>20 min，判读时间<15 min。

1.5 检测方法参照《全国艾滋病检测技术规范》进行检测，双波长450 nm/ 630 nm，标本值<0.1+阴性对照值均值则为阴性，≥0.1+阴性对照值均值则为阳性，阴性对照值>0.1且阳性对照值<0.5表明检测失败。连续检测4次。

1.6 观察指标(1) ELISA法进行HIV抗体筛查结果及市疾病防控中心确认结果；(2) ELISA法检测HIV抗体的影响因素。

2 结果

2.1 检测结果3 144例血液标本经两种试剂盒4次检测结果均一致，阳性11例，阳性率为0.35%。见表1。送至本市疾病防控中心确认，阳性4例，阳性率为0.13%。

表1 两种试剂盒4次检测结果(n)

2.2 影响因素ELISA检测HIV抗体过程中7例假阳性影响因素分别为：1例由于血液标本未妥善处理，受异嗜性抗体影响；3例血液标本污染；3例血液标本出现溶血。

3 讨论

现阶段，我国HIV感染者较多，但感染者对自身健康状况并不了解，通过抗体检测才能最终确认。因此，提高临床筛查准确度，避免检测过程中影响因素干扰尤为重要。本研究结合临床经验分析HIV抗体ELISA检测过程各个阶段，以找出对检测结果存在影响的相关因素，提出干预措施进行预防，达到减少假阳性、假阴性的目的。

血液标本是临床检测主体，若标本受到污染，出现溶血，贮存不当及处理不当等易影响检测结果，从而出现假阴性、假阳性情况。血液标本影响因素分为内源性干扰因素和外源性干扰因素，其中外源性主要为标本采集、运送、贮存过程中出现问题，导致标本受污染或溶血，另外贮存时间过长、抗凝物加入同样会影响检测结果[2]。本研究应对措施如下：标本采集避免溶血，采集后自然放置1～2 h，血块收缩、血液凝固后进行离心处理，血清立即检测，若保存时间>7 d则保存于-20 ℃环境中；需抗凝时避免使用酶抑制剂，防止降低酶活性。内源性干扰因素主要指类风湿因子、补体、异嗜性抗体、非特异性免疫球蛋白等[3]。本研究应对措施如下：给予 pH=7.2的0.01 mol·L-1磷酸盐进行稀释，比例为1∶1，进行血清灭活30 min，温度56 ℃。

试剂选择需经注册批准且检验合格，经临床评估结果、鉴定报告等对比后选择特异度、灵敏度较高的试剂盒，注意在有效期；检测前的预处理十分重要，但基层检验人员易忽略。本研究则在检测前将其取出置于室温下放置20～30 min，保证使用前与室温尽量一致，避免由于温度原因影响抗体抗原反应速度，进而影响检测结果；对同批号试剂盒进行内部对照，确保试验有效性。

标本质量对临床检测过程极为重要，血清是临床最常用标本，血清分离时必须完全彻底分离，避免出现纤维蛋白伴血清标本加入反应孔而在孔底吸附，造成假阳性。血清标本需冷冻保存，注意保存时勿反复冻融，其原因在于标本反复冻融会产生机械剪切力，破坏蛋白分子，导致假阴性[4]。另外，溶血标本所出现的游离血红蛋白具有过氧化物酶作用，可通过催化辣根过氧化物酶底物显色造成假阳性[5-6]。但临床实际操作时、试验前均会进行2次洗板，将参与的游离血红蛋白清除，使其对临床检测几乎无影响。

仪器及操作人员技术对临床检测结果有一定的影响，HIV抗体检测需严格遵守《全国艾滋病检测技术规范》流程。操作人员须严格消毒，穿戴工作衣、手套，按照说明书规范使用移液器，加样时孔内按照规定量添加，勿在边缘位置加样，注意吸头勿碰到抗原，快放慢吸，避免溅出、出现气泡；加样完成更换吸头，避免交叉感染；滴加试剂前摇匀，并将第1滴挤去，避免出现气泡；移液器需定期校正。ELISA判断结果为酶催化底物显色，而酶催化底物、抗体抗原结合效率均与温度密切相关：温度过高则显色较深，温度较低则显色较浅，对临床检测结果准确性有明显影响[7-8]。温度对ELISA检测成功与否十分关键[9-10]。ELISA检测时控制温度后需调控恒温箱，在明确恒温箱面板温度的同时，在箱内放置温度计，避免温差影响检测结果；抗体最合适反应温度为37 ℃，保证抗体抗原充足的反应时间。另外，洗板对ELISA检测非常关键，参照说明书设置洗涤次数、浸泡时间，完成后还应以蒸馏水进行冲洗，避免堵塞；注意试剂盒洗涤剂勿混合使用，使用不同酶标板时调整吸液头，避免卡住，及时更换破损吸液头。

综上，ELISA法检测HIV抗体影响因素涉及标本、采集、试剂选择和处理、温度调控、操作人员技术等各个方面。通过对标本、试剂、温度及操作流程进行干预，可有效避免假阳性、假阴性出现。临床应消除影响因素干扰，提高检测准确率，确保检测结果准确可靠。