葛根素通过抑制IκBα/NF-κB p65信号轴缓解大鼠非酒精性脂肪肝损伤

胡波， 徐颖， 丁辉， 方学奇， 王天宝

（1.河南省人民医院医学部，河南郑州 450000；2.解放军联勤保障部队第九八八医院药剂科，河南郑州 450007；3.河南省人民医院消化内科，河南郑州 450000；4.解放军联勤保障部队第九八八医院医务处，河南郑州 450007；5.新乡医学院第一附属医院肝脏中心，河南卫辉 453100）

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）指由非酒精因素导致的肝细胞内脂肪过度沉积的慢性肝病，被认为是代谢综合征在肝脏的表现形式[1]。NAFLD 与胰岛素抵抗[2]、糖尿病[3]、肥胖[4]、遗传易感性[5]密切相关，可从单纯性脂肪肝发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化，甚至是肝癌[6]。随着肥胖人群的增多，伴随的代谢综合征使这部分肥胖人群患上NAFLD 的风险大大提高[7]。因此，防治NAFLD 具有重要的意义。葛根，为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，味甘、辛，性平，入脾、胃经，可解肌退热，透疹，生津，止泻。葛根素（puerarin）是从葛根中提取的单体，分子式为C21H20O9，分子量为416，具有舒张血管[8]、抗氧化[9]、抗癌[10]、抗炎[11]、减轻胰岛素抵抗[12]等广泛药理活性，可用于防治NAFLD。有研究[13]显示，核因子（NF）κB 抑制剂α（IκBα）/NF-κB p65 途径在胰岛素抵抗的发生中发挥着重要的作用。本研究旨在探讨葛根素通过IκBα/NF-κB p65 途径对NAFLD 大鼠肝功能和脂代谢作用的影响，以期为其在NAFLD 的临床应用提供理论依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1动物60 只SPF 级SD 雄性大鼠，6 ～8 周龄，体质量（200 ± 20）g，购自北京维通利华实验动物公司，动物质量合格证号:SCXK（京）2018-0002。将大鼠饲养于室温25 ℃左右、湿度50%的环境中，提供12 h 的正常光照条件，并提供清洁饮水。

1.2药物葛根素（由中国食品药品检定研究院提供，批号:110752-201816）；多烯磷脂酰胆碱胶囊（成都天台山制药有限公司，批号:160220）。

1.3试剂与仪器苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（上海碧云天公司）；改良油红O 染色液（北京索莱宝公司）；Caspase-3、Caspase-9、IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、GAPDH 等抗体（美国Abcam 公司）；增强型电化学发光（ECL）试剂盒（南京诺唯赞生物公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、一氧化氮合酶（iNOS）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（南京建成生物研究所）。垂直电泳槽、转印仪、ChemiDoc MP 凝胶成像仪、酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；全自动生化分析仪（南京基蛋生物公司）。

1.4分组、造模与给药将60只大鼠随机分为正常对照组，模型对照组，葛根素低、中、高剂量组，多烯磷脂酰胆碱组，每组10 只。正常对照组用标准饲料喂养，其他4 组每天用高脂饲料（标准饲料的基础上加质量分数10%猪油、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%蛋黄粉）喂养构建NAFLD 模型，另外，多烯磷脂酰胆碱组给予多烯磷脂酰胆碱50 mg·kg-1·d-1灌胃[14]，葛根素低、中、高剂量组分别给予葛根素10、50、100 mg·kg-1·d-1灌胃[15-16]，正常对照组和模型对照组给予等容量9.0 g/L氯化钠溶液灌胃，均连续灌胃12周。通过NAFLD模型大鼠肝功能异常及病理变化的结果可判断造模成功与否。

1.5观察指标与方法

1.5.1 HE 染色观察大鼠肝脏组织病理变化 处死大鼠后，打开腹腔取出肝脏，将肝脏剪切成组织块并经40 g/L 多聚甲醛溶液固定48 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后制作石蜡切片。按照HE 染色试剂盒说明书进行染色，中性树胶封固，显微镜下观察。

1.5.2 油红O染色观察大鼠肝脏脂肪堆积情况 制作5 μm 厚肝脏冰冻切片，并使用体积分数为10%福尔马林溶液固定10 min，清洗后置于体积分数60%异丙醇内浸洗30 s，使用油红O 染液染色10 min。60%异丙醇分化处理5 min，清洗后经苏木素复染1 min，自来水漂洗10 min，吸干水分后使用甘油明胶封片，显微镜下观察。镜下可见肝细胞内脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色。

1.5.3 生化指标检测 经腹主动脉收集各组大鼠血液，以3 000 r/min离心15 min分离血清，用全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）水平。

1.5.4 ELISA 法检测大鼠外周血中TNF-α、IL-6、iNOS 水平 具体操作步骤按照ELISA 试剂盒说明书进行。

1.5.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测大鼠肝组织中Caspase-3、Caspase-9 的表达及IkBα、NF-κB p65磷酸化情况 充分匀浆大鼠肝组织，并充分裂解，提取总蛋白。蛋白变性后，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，将蛋白转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，以50 g/L 脱脂牛奶室温封闭2 h，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗脱后分别孵育Caspase-3、Caspase-9、

IκBα、 p- IκBα、 NF- κB p65、 p- NF- κB p65、GAPDH 等一抗，孵育二抗，加入BCL 进行曝光，用ImageJ软件对蛋白质条带灰度值进行分析。

1.6统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，所有实验数据均以均数± 标准差（x ± s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较分析采用Bonferroni 法。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1葛根素减轻NAFLD大鼠肝脏损伤表1 结果显示:与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中ALT、AST含量显著增高（P ＜0.05）；与模型对照组比较，葛根素中、高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组ALT、AST 含量显著降低（P ＜0.05）；与多烯磷脂酰胆碱组比较，葛根素高剂量组大鼠血清中ALT、AST含量无明显差异（P ＞0.05）。图1结果显示:正常对照组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞索排列整齐，肝细胞体积较大，细胞核居中，胞质丰富，无炎症细胞浸润；模型对照组大鼠肝脏中存在大量脂肪空泡，伴有肝细胞核固缩和炎症细胞浸润，肝细胞索排列紊乱；多烯磷脂酰胆碱组肝脏中无明显脂肪空泡和脂肪变性表现，肝小叶结构较完整，肝细胞索排列整齐，无明显炎症细胞浸润；经葛根素治疗后，各葛根素剂量组肝脏细胞形态恢复，且随葛根素剂量的增加大鼠肝脏病理学改变较模型对照组逐渐减轻。

表1 各组大鼠血清中ALT、AST含量比较Table 1 Comparison of the serum contents of ALT and AST of rats in various groups（±s，U·L-1）

表1 各组大鼠血清中ALT、AST含量比较Table 1 Comparison of the serum contents of ALT and AST of rats in various groups（±s，U·L-1）

①P ＜0.05，与正常对照组比较；②P ＜0.05，与模型对照组比较；③P ＜0.05，与多烯磷脂酰胆碱组比较

AST 45.34±9.39 87.02±14.45①59.58±12.14②82.19±18.54 63.36±10.42②③47.07±9.27②组别正常对照组模型对照组多烯磷脂酰胆碱组葛根素低剂量组葛根素中剂量组葛根素高剂量组鼠数（只）10 10 10 10 10 10 ALT 24.87±15.36 147.23±25.12①68.64±16.93②143.02±21.67 94.19±18.54②③59.21±15.49②

2.2葛根素缓解NAFLD大鼠肝脏炎症反应表2结果显示:与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中TNF-α、iNOS 和IL-6 含量显著增高（P ＜0.05）；与模型对照组比较，葛根素中、高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组TNF-α、iNOS 和IL-6 含量显著降低（P ＜0.05）；与多烯磷脂酰胆碱组比较，葛根素高剂量组大鼠血清中TNF-α、iNOS 和IL-6 含量无明显差异（P ＞0.05）。

图1 各组大鼠肝组织病理变化比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological features of liver tissue of rats in various groups（by HE staining，×200）

2.3葛根素缓解NAFLD大鼠肝细胞凋亡图2、表3结果显示:与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝组织中Caspase-3 和Caspase-9 表达水平显著上调（P ＜0.05）；与模型对照组比较，葛根素中、高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组Caspase-3 和Caspase-9表达水平显著下调（P ＜0.05）；与多烯磷脂酰胆碱组比较，葛根素高剂量组大鼠组织中Caspase-3 和Caspase-9 表达水平无明显差异（P ＞0.05）。

表2 各组大鼠血清中炎症因子TNF-α、iNOS、IL-6含量比较Table 2 Comparison of the serum contents of inflammatory factor TNF-α，iNOS，IL-6 of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

表2 各组大鼠血清中炎症因子TNF-α、iNOS、IL-6含量比较Table 2 Comparison of the serum contents of inflammatory factor TNF-α，iNOS，IL-6 of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

①P ＜0.05，与正常对照组比较；②P ＜0.05，与模型对照组比较；③P ＜0.05，与多烯磷脂酰胆碱组比较

组别正常对照组模型对照组多烯磷脂酰胆碱组葛根素低剂量组葛根素中剂量组葛根素高剂量组IL-6 15.03±0.35 96.35±15.43①41.12±7.35②89.53±14.26 57.19±10.28②③34.56±11.24②鼠数（只）10 10 10 10 10 10 TNF-α 25.27±1.38 164.65±25.23①57.66±6.98②158.73±26.67 95.19±14.52②③48.32±9.47②iNOS 42.08±8.39 218.12±34.45①83.01±15.14②207.48±28.54 121.83±17.42②③75.26±12.27②

图2 各组大鼠肝组织中凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的Western Blot电泳条带Figure 2 Western blotting strips of apoptosis protein Caspase-3，Caspase-9 in rat liver tissue of various groups

表3 各组大鼠肝组织中凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9相对表达量比较Table 3 Comparison of the relative expression contents of apoptosis protein Caspase-3，Caspase-9 in rat liver tissue of various groups （±s）

表3 各组大鼠肝组织中凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9相对表达量比较Table 3 Comparison of the relative expression contents of apoptosis protein Caspase-3，Caspase-9 in rat liver tissue of various groups （±s）

①P ＜0.05，与正常对照组比较；②P ＜0.05，与模型对照组比较；③P ＜0.05，与多烯磷脂酰胆碱组比较

Caspase-9相对表达量0.02±0.01 0.24±0.04①0.04±0.01②0.21±0.02 0.09±0.06②③0.03±0.02②组别正常对照组模型对照组多烯磷脂酰胆碱组葛根素低剂量组葛根素中剂量组葛根素高剂量组鼠数（只）10 10 10 10 10 10 Caspase-3相对表达量0.00±0.02 0.37±0.06①0.05±0.01②0.32±0.01 0.11±0.05②③0.04±0.02②

2.4葛根素缓解NAFLD大鼠肝脏脂肪沉积图3结果显示:正常对照组大鼠肝细胞形态清晰，胞质透明，细胞核呈现蓝色，无明显红色脂滴；模型对照组大鼠肝细胞形态不规则，胞质中沉积大量脂肪；多烯磷脂酰胆碱组肝细胞形态较为清晰，镜下仅见少红色脂滴沉积；经葛根素干预后，随葛根素剂量增加，肝细胞中脂肪沉积逐渐减少，且在葛根素高剂量组中仅可见少量脂滴。

图3 各组大鼠肝脏脂肪沉积情况比较（油红O染色，×200）Figure 3 Comparison of hepatic fat deposition in various groups（by oil red O staining，×200）

2.5葛根素降低NAFLD大鼠血脂水平表4 结果显示:与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中TC、TG和LDL含量显著增加，而HDL含量显著降低（P ＜0.05）；与模型对照组比较，葛根素中、高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组血清中TC、TG 和LDL 含量显著降低，而HDL 含量显著增加（P ＜0.05）；与多烯磷脂酰胆碱组比较，葛根素高剂量组大鼠血清中TC、TG、LDL 和HDL 含量均无明显差异（P ＞0.05）。

2.6葛根素抑制IκBα/NF-κB p65信号通路活性图4、表5 结果显示:与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝组织的p-IκBα/IκBα 比值和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值显著上调（P ＜0.05）；与模型对照组比较，葛根素中、高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组p-IκBα/IκBα 比值和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值显著下调（P ＜0.05）；与多烯磷脂酰胆碱组比较，葛根素高剂量组p-IκBα/IκBα 比值和p-NFκB p65/NF-κB p65 比 值 表 达 无 明 显 差 异（P ＞0.05）。

表4 各组大鼠血脂水平比较Table 4 Comparison of the rat blood lipids levels of various groups（±s，mmol·L-1）

表4 各组大鼠血脂水平比较Table 4 Comparison of the rat blood lipids levels of various groups（±s，mmol·L-1）

①P ＜0.05，与正常对照组比较；②P ＜0.05，与模型对照组比较；③P ＜0.05，与多烯磷脂酰胆碱组比较

组别正常对照组模型对照组多烯磷脂酰胆碱组葛根素低剂量组葛根素中剂量组葛根素高剂量组LDL 0.17±0.03 0.73±0.06①0.28±0.05②0.69±0.09 0.36±0.05②③0.21±0.03②鼠数（只）10 10 10 10 10 10 TC 1.23±0.34 4.64±0.54①1.72±0.35②4.48±0.62 2.35±0.34②③1.46±0.41②TG 0.42±0.09 1.79±0.25①0.68±0.14②1.66±0.34 1.01±0.12②③0.55±0.17②HDL 1.34±0.36 0.42±0.23①1.16±0.23②0.46±0.16 1.02±0.18②③1.38±0.44②

图4 各组大鼠肝组织中p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65的Western Blot电泳条带Figure 4 Western blotting strips of p-IκBα，IκBα，p-NF-κB p65，NF-κB p65 in rat liver tissue of various groups

表5 各组大鼠肝组织IκBα、NF-κB p65磷酸化水平的比较Table 5 Comparison of the phosphorylated expression levels of IκBα，NF-κB p65 in rat liver tissue of various groups （±s）

表5 各组大鼠肝组织IκBα、NF-κB p65磷酸化水平的比较Table 5 Comparison of the phosphorylated expression levels of IκBα，NF-κB p65 in rat liver tissue of various groups （±s）

①P ＜0.05，与正常对照组比较；②P ＜0.05，与模型对照组比较；③P ＜0.05，与多烯磷脂酰胆碱组比较

p-NF-κB p65/NF-κB p65比值0.03±0.01 0.58±0.07①0.04±0.01②0.54±0.06 0.14±0.04②③0.05±0.02②组别鼠数（只）正常对照组模型对照组多烯磷脂酰胆碱组葛根素低剂量组葛根素中剂量组葛根素高剂量组10 10 10 10 10 10 p-IκBα/IκBα比值0.02±0.01 0.72±0.04①0.08±0.03②0.68±0.06 0.22±0.05②③0.04±0.02②

3 讨论

在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）发生发展过程中除了单纯的肝脏脂肪变性外，还可见到不同程度的肝脏功能损伤、炎症反应和纤维化。ALT 和AST是肝实质受损的标志物，当肝脏受损时ALT和AST会被大量释放进入血液。本研究结果显示，葛根素可下调NAFLD 大鼠血清中ALT、AST 水平，减轻肝功能损伤，修复肝脏组织结构病理改变。

TNF-α 是参与炎症的重要介质，可激活炎症级联反应，促进IL-6、iNOS 的大量表达，引起机体炎症反应和组织损伤[17]。本研究结果显示，葛根素可减少NAFLD 大鼠炎症因子TNF-α、iNOS 和IL-6 的含量，减轻NAFLD 大鼠炎症反应。有研究表明，肝缺血再灌注后发生显著的细胞凋亡现象。本研究结果显示，葛根素可下调NAFLD 大鼠肝脏中凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表达，抑制肝细胞凋亡，修复大鼠肝脏损伤。

脂肪合成的过程主要发生在肝脏，当脂肪的合成能力超过脂肪的消耗时便可造成脂肪过多累积在肝脏，引发脂肪肝。NAFLD 的发生与患者血脂水平直接相关，且与肝脂肪病变程度呈正相关[18]。本研究结果显示，葛根素可下调NAFLD 大鼠血清中TG、TC、LDL 含量，并上调HDL 水平，减少脂肪在大鼠肝脏中的沉积。

NF-κB是重要的核转录因子，通常与IκB形成复合体存在于细胞质，当被刺激因素激活后核转移过程增强，参与调控炎症因子TNF-α、IL 等的表达，最终导致肝脏炎症反应的发生。本研究结果显示，葛根素可下调NAFLD 大鼠肝组织中IκBα、NF-κB p65 磷酸化水平，表明葛根素可能通过抑制IκBα/NF-κB p65 信号通路活性，进而减轻NAFLD大鼠肝脏中的炎症反应，改善肝脏损伤。

综上所述，葛根素可能通过抑制IκBα/NF-κB p65 信号轴活性修复NAFLD 大鼠肝脏脂肪沉积所导致的肝损伤，同时还具有调节血脂的重要功效，对NAFLD 起到积极的治疗作用。下一步我们将构建人正常肝细胞株L-02 细胞脂肪变性模型，深入探究IκBα/NF-κB p65 信号轴在肝细胞脂肪变性中的作用。