高效液相色谱法测定鲑降钙素中醋酸含量的不确定度的评定
2021-01-21李兰兰李坦城胡光华孙丽艳张红丹
李兰兰，李坦城，胡光华，孙丽艳，张红丹
（长春市食品药品检验中心，吉林 长春 130000）
不确定度作为衡量测定质量的标志，为检测结果的比较带来很大方便。目前不确定度概念已经深入各行各业，在科研、制标、实验室认可等方面发挥着重要作用。本文以高效液相法测定鲑降钙素中醋酸含量为例，探讨了该方法不确定度的来源、评定、合成及结果的表述，建立了该方法的数学模型。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪；XA205电子天平、S-210酸度计（梅特勒公司）。玻璃量器均已检定。甲醇（色谱纯），磷酸、氢氧化钠（分析纯），实验用水为一级水。
冰醋酸购自天津北联精细化学开发有限公司。鲑降钙素，批号：SG649901，购自酷尔生物。
1.2 实验方法
《中国药典》2015年版二部，高效液相色谱法测定鲑降钙素中醋酸含量。
1.2.1 样品处理
对照品溶液：精密称取冰醋酸对照品250mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml至50ml量瓶中，用流动相定量稀释至刻度，即得。
供试品溶液：精密称取本品8mg，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.2.2 测定方法
实验条件：
流动相：流动相A：磷酸溶液（在1000ml水中加磷酸0.7ml，用0.42%氢氧化钠溶液调节pH值至3.0）流动相B：甲醇，进行梯度洗脱：
0-5min：95%A，5%B；5-10min：50%A，50%B；20-30 min：95%A，5%B；
色谱柱：InertSustain C18 5μm 4.6×250mm,S/N4AR98020
流速：1.2ml/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10µl
2 数学模型
3 结果与分析
3.1 不确定度来源
（1）对照品制备：称量过程u(m)、对照品纯度u(p)、定容过程u(v1)，稀释过程u(v2)；
（2）供试品制备：称量过程u(m)、样品纯度u(p)。
3.2 各不确定度分量
3.2.1 对照品制备引入的不确定度
3.2.1.1 称量过程
试验中天平置信区间为0.01mg，按均匀分布：
称量两次，天平引起的标准不确定度:
称量醋酸天平的相对不确定度：
称量鲑降钙素天平的相对不确定度：
3.2.1.2 对照品纯度
醋酸对照品说明书未提供不确定度，在此不参加计算。
3.2.1.3 定容过程
①JJG196-1990规定，20℃时25ml A级容量瓶容量允差为0.030ml，，取三角形分布：
②温度
实验温差以3℃计，用流动相定容。
有机溶剂的膨胀系数=1×10-3水膨胀系数= 2.1×10-43℃差异 P = 0.95时 C = 1.96
定容醋酸对照品的标准不确定度：
相对不确定度：
3.2.1.4 稀释过程
（1）5ml移液管带来不确定度
①JJG196-1990规定，20℃时5mL A级移液管容量允差为0.020ml，取三角形分布： u (V5ml1)==0.008167ml
②温度
参考3.1.1.3②
u (V5ml2)= 0.001909ml
5ml移液管引起的标准合成不确定度：
5ml移液管引起的相对不确定度：
由稀释引起的相对不确定度：
3.2.1.5 定容过程
①JJG196-1990规定，20℃时50mL A级容量瓶容量允差为0.050ml，取三角形分布：
②温度
参考3.1.1.3②u (V定2)= 0.01909ml
由定容醋酸对照品引起的标准合成不确定度：
相对不确定度：
对照品制备过程引入的相对不确定度：
3.3 供试品制备的不确定度
3.3.1 10ml容量瓶带来的不确定度
①JJG196-1990规定，20℃时10mL A级容量瓶的容量允差为0.020ml，取三角形分布：
②温度
公式条件同3.1.1.3②
u (V)= 0.003818
10ml容量瓶引起的标准合成不确定度：
供试品制备过程引起的相对不确定度：
3.4 液相色谱仪的不确定度
计量检定证书给出RSD为0.06% ，对照品和样品峰面积相对不确定度为：
3.5 结果的重复性引入的不确定度
日常检测采用标准化残差标准差。4组原始数据标准化残差为0.0152，两次测量平均值的相对标准不确定度：
3.6 合成相对不确定度
合成标准不确定度：
7.0 %×0.01105 = 0.08%
3.7 扩展不确定度
U = Ku （K=2）
= 0.08% ×2 ≈ 0.2%
3.8 报告结果
C = （ 7.0%±0.2% ） （k=2）
当置信概率为95%时，分散区间为（ 7.0%±0.2% ）
4 结果讨论
整个实验过程需充分考虑各影响因素对不确定度的影响。其中主要因素来源于重复测量，对照品及供试品制备过程，在实验过程中，应控制好影响较大的因素。对照品和样品的纯度不确定度也会影响结果，由于所用对照品和样品均未提供纯度，忽略其对本次实验结果的影响。在实验过程中，温度变化带来的不确定度不容忽视，实验过程中应严格监测环境温度变化。
