采前1-甲基环丙烯处理对货架期‘Bartlett’梨虎皮病和抗氧化特性的影响

李英丽，张少颖，董 宇

（1.河北农业大学园艺学院，河北省梨工程技术研究中心，河北 保定 071001；2.美国俄勒冈州立大学，哥伦比亚农业研究与推广中心，美国 俄勒冈 胡德里弗 97031；3.山西师范大学食品科学学院，山西 临汾 041004）

‘Bartlett’梨是西洋梨的主要栽培品种之一，贮藏后易发生虎皮病，是限制其长期贮藏的主要因素。20世纪初，Brooks等提出了虎皮病的形成与自身代谢产生的挥发物质有关[1]。1966年，Huelin等证实了虎皮病与α-法尼烯合成密切相关[2]。后来的研究证明，果实表皮中共轭三烯的大量积累引起了虎皮病的发生，该物质是α-法尼烯的氧化产物[3]。然而许多研究也发现，不同苹果和梨品种虎皮病的形成与果皮中α-法尼烯和共轭三烯的含量无显著的相关性，与果实抗氧化能力密切相关[4-6]。抗氧化物质含量和抗氧化酶活性的降低导致膜脂过氧化，细胞结构完整性被破坏，多酚物质被氧化成醌类物质，果实表皮细胞积累大量醌类物质，导致虎皮病的发生[7-8]。目前，关于虎皮病发生的机理尚不清楚。

二苯胺和乙氧基喹可有效防止果实虎皮病的发生，但由于二苯胺残留和乙氧基喹毒害问题，在许多国家已禁止使用[9-10]。目前，农业生产中广泛应用采后1-甲基环丙烯（1-methylcyclopene，1-MCP）处理水果抑制虎皮病的发生。研究表明，采后进行1-MCP处理可有效抑制贮藏期间梨果实虎皮病的发生，提高果实硬度，减缓果皮叶绿素、可滴定酸含量的下降[11-13]。但采后1-MCP处理能够影响西洋梨果实的后熟[14]，且对使用场所要求严格，处理后需要通风换气。美国Agrofresh公司发明了一种悬浮剂型1-MCP（HarvistaTM），该产品对场地无特殊要求，可直接进行采前喷施，操作简单、方便。许多研究表明，采前喷施1-MCP能延长采收期、提高果实贮藏性、降低虎皮病的发生率[15-16]。但关于采前1-MCP处理对果实抗氧化代谢系统的影响研究较少。本研究旨在探讨采前1-MCP处理对‘Bartlett’梨贮藏后抗氧化物含量和抗氧化酶活性的影响，为今后虎皮病的调控提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验于2016年在美国俄勒冈州Parkdale的商品果园进行，供试品种为‘Bartlett’梨（Pyrus communisL.），20 年生，砧木为榅桲，栽植密度3 m×5 m。

悬浮剂型1-MCP（HarvistaTM） 美国Agrofresh公司。

1.2 仪器与设备

GC-8A气相色谱仪 日本Shimadzu公司；900161便携式二氧化碳测定仪 美国Bridge Analyzers有限公司；DA Meter水果成熟度无损检测仪 意大利Sinteleia公司；高速冷冻离心机 美国Sigma公司；CO2压力喷雾机 美国AgroFresh公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

选择长势一致、负载量相近的20 年生‘Bartlett’梨树作为样品树，实验采用完全随机设计，每个处理6 棵树，3 次重复。成熟前15 d（2016年7月29日）采用CO2压力喷雾机喷施1-MCP溶液，每棵喷施2 L 300 mg/L 1-MCP溶液，以喷清水为对照。2016年8月13日采收，选取树冠外围东、南、西、北4 个方向的无机械损伤和病虫害的果实，放入衬有微孔聚乙烯袋的木箱内，每个木箱70 个果实。果实采后4 h放入（－1.1±0.5）℃冷库，相对湿度为90%～95%，贮藏一段时间后取出在常温（20.0±1.0）℃下测定梨果实的虎皮病发生率和抗氧化活性，分别在室温下放置1、3 d和5 d后进行测定。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 虎皮病病情指数测定

参考何近刚等[13]的方法，冷藏后每隔1 个月，将果实从冷库中取出放置在室温（20.0±1.0）℃条件下，放置1、3 d和5 d时观察虎皮病发生情况。0级：无病斑；1级：病斑面积比小于1/4；2级：病斑面积比小于1/2；3级：病斑面积比大于1/2。每次处理30 个果，3 次重复。虎皮病病情指数按下式计算。

统计后的果实用于乙烯生成速率、呼吸速率和抗氧化性的测定。实验发现，冷藏前3 个月无虎皮病发生，5 个月后虎皮病发生率较高，果实失去了商品价值，因此生理指标在冷藏4 个月后取出放在室温下1、3、5 d后测定。

1.3.2.2 呼吸速率和乙烯生成速率测定

参考Xie Xingbin等[10]的方法测定呼吸速率和乙烯生成速率。选取5 个无损伤、大小均匀的果实，称质量后放置在3.8 L的密闭罐内，3 次重复。密封1 h后，用便携式二氧化碳测定仪测定密闭罐中的CO2质量，呼吸速率以每千克鲜果实每分钟释放的CO2质量表示，单位为μg/（kg·min）。然后抽取密闭罐上部1 mL的气体，注入GC-8A气相色谱仪中，用于测定乙烯质量浓度。检测器温度为140 ℃，进样口的温度为90 ℃，载气N2的流速为0.8 mL/s，乙烯生成速率以每千克鲜果实每分钟释放的乙烯质量表示，单位为μg/（kg· min）。

1.3.2.3α-法尼烯、共轭三烯含量测定

参考Zhao Jing等[7]的方法测定α-法尼烯、共轭三烯含量。选取10 个无损伤、大小均匀果实，3 次重复，用水果刀削取带1 mm厚果肉的果皮，用直径1 cm的打孔器取20 片果皮，称质量后放入50 mL离心管中，加入12 mL正己烷，避光振荡提取30 min。取提取液于232 nm波长处测定吸光度以计算得到α-法尼烯含量，于281 nm和292 nm波长处测定吸光度以得到共轭三烯含量，单位均为μmol/kg。剩余果皮立即用液氮冷冻，贮藏在－80 ℃冰箱中，用于抗氧化活性、抗氧化物质含量、抗氧化酶活力和丙二醛含量的测定。

1.3.2.4 DPPH自由基清除能力、抗氧化物质含量的测定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和总黄酮、总酚和花青苷含量测定参考Dong Yu等[17]的方法。取1.0 g果皮加入预冷的7.5 mL提取液（V（乙醇）∶V（丙酮）＝7∶3），冰浴研磨，混匀后4 ℃、10 000×g离心20 min，上清液用于DPPH自由基清除能力、总黄酮和总酚含量的测定，单位均为mg/g。

花青苷含量测定：取0.5 g果皮，加入5 mL提取液（V（甲醇）∶V（盐酸）＝99∶1），研磨、混匀，室温（20.0±1.0）℃下避光放置24 h，然后在13 000×g离心5 min。取上清液，用紫外分光光度计测定530、620 nm和650 nm波长处的吸光度，单位为mg/kg。

1.3.2.5 抗氧化酶活力和丙二醛含量的测定

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力测定参照宋松泉[18]的方法。取1.0 g果皮，加5 mL提取液（含50 mmol/L pH 7.8磷酸缓冲液、1%聚乙烯吡咯烷酮、1 mmol/L抗坏血酸、1 mmol/L乙二胺四乙酸），冰浴研磨，4 ℃、10 000×g离心20 min。取0.3 mL上清液，加入3 mL反应液（含50 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液、1 mmol/L抗坏血酸），最后加50 μL H2O2启动反应，测定3 min内290 nm波长处的吸光度变化量，以不加H2O2作为对照。以每克样品每分钟吸光度减少0.01为1 个APX活力单位（U），单位为U/（g·min）。

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力测定参考李合生[19]的方法。取果皮0.5 g，加3 mL pH 7.8磷酸盐缓冲液冰浴研磨，混匀后4 ℃、10 000×g离心20 min。取0.1 mL上清液，分别加入2.91 mL pH 7.0磷酸盐缓冲液、50 μL愈创木酚和20 μL H2O2。每隔1 min读取470 nm波长处的吸光度，测定4 min内的吸光度变化，以每克鲜样品每分钟吸光度减少1为1 个POD活力单位（U），单位为U/（g·min）。

过氧化氢酶（catalase，CAT）活力测定参考李合生[19]的方法。取果皮1.0 g，加3 mL pH 7.8磷酸盐缓冲液冰浴研磨，4 ℃、10 000×g离心20 min。取0.1 mL上清液，加入2.9 mL H2O2，反应15 s后测定240 nm波长处的吸光度，间隔30 s读取吸光度，连续读取6 个数据点。以每克样品每分钟吸光度减少0.01为1 个CAT活力单位（U），单位为U/（g·min）。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定参照郝再彬等[20]的硫代巴比妥酸比色法。取1.5 g果皮，加入5 mL、质量分数10%三氯乙酸溶液冰浴研磨，混匀后4 ℃、10 000×g离心15 min。取1 mL上清液，加入3 mL硫代巴比妥酸反应液，混匀后沸水浴20 min，然后立即放入冰水中冷却。分别测定450、532 nm和600 nm波长处的吸光度，丙二醛含量单位为mmol/g。

1.4 数据统计与分析

利用WPS 2019软件统计数据和作图，运用SPSS 17.0软件进行方差分析，利用T检验和Duncan's多重比较进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 1-MCP对‘Bartlett’梨虎皮病发生的影响

表1 1-MCP对‘Bartlett’梨虎皮病病情指数的影响Table 1 Effect of 1-MCP treatment on superfciial scald of ‘Bartlett'pears %

图1 冷藏4 个月（A）和5 个月（B）后对照和1-MCP处理‘Bartlett’梨在室温下放置5 d的虎皮病发生情况Fig.1 Appearance of control and 1-MCP treated‘Bartlett' pears after cold storage for 4 (A) or 5 (B) months

从表1、图1可以看出，随着贮藏时间的延长，虎皮病病情指数呈现上升的趋势。贮藏前3 个月，果实没有虎皮病的发生。贮藏4 个月后，室温下对照组果实虎皮病病情指数呈现显著上升的趋势，而采前1-MCP处理的果实虎皮病发生率显著低于对照组（P＜0.05），表明1-MCP处理可有效抑制虎皮病的发生。贮藏4 个月后室温下放置5 d，1-MCP处理组果实未出现虎皮病症状，对照组果实虎皮病病情指数为8.48%。贮藏5 个月后室温下放置3 d，2 个组别果实均出现虎皮病，室温下放置3 d和5 d后，对照组虎皮病病情指数分别为33.32%和71.36%，1-MCP处理组分别为16.67%和31.98%，同时期这两组的虎皮病发生指数均差异显著（P＜0.05）。这表明1-MCP处理推迟了虎皮病发生时间并降低了病情指数。

2.2 1-MCP对‘Bartlett’梨α-法尼烯和共轭三烯含量的影响

从图2A可以看出，室温下放置1 d，对照组果皮中的α-法尼烯含量（339.12 μmol/kg）显著高于1-MCP处理组（293.53 μmol/kg）。两组α-法尼烯含量均在1～3 d下降，在3～5 d小幅升高。对照组和1-MCP处理组的α-法尼烯含量在3 d时最低，分别为189.20 μmol/kg和148.25 μmol/kg，5 d时分别升高至241.82 μmol/kg和198.93 μmol/kg。室温下放置过程中，1-MCP处理组的α-法尼烯含量均显著低于对照组（P＜0.05），这表明1-MCP处理可抑制α-法尼烯的合成。

如图2B所示，室温下共轭三烯含量的变化与α-法尼烯相似。冷藏4 个月后，对照组室温下放置5 d共轭三烯的含量达到最高，此时果实发生虎皮病。室温下1-MCP处理组的共轭三烯含量均显著低于对照组，无虎皮病的发生。这表明1-MCP处理抑制了α-法尼烯的氧化，减少了共轭三烯的积累。

图2 1-MCP处理对‘Bartlett’梨α-法尼烯（A）和共轭三烯（B）含量的影响Fig.2 Effect of 1-MCP treatment on the contents of α-farnesene (A)and conjugated trienes (B) of ‘Bartlett' pears

2.3 1-MCP对‘Bartlett’梨呼吸速率和乙烯生成速率的影响

图3 1-MCP处理对‘Bartlett’梨呼吸速率（A）和乙烯生成速率（B）的影响Fig.3 Effect of 1-MCP treatment on respiration rate (A) and ethylene production rate (B) of ‘Bartlett' pears

从图3 A 可以看出，室温下果实的呼吸速率呈现先升高后减低的趋势。对照组和1-MCP处理组果实的呼吸速率均在室温下放置3 d达到最高，分别为1 349.90 μg/（kg· min）和1 077.82 μg/（kg· min），1-MCP处理组显著低于对照组水平；随后对照组的呼吸速率快速下降，1-MCP处理组变化缓慢，表明1-MCP处理抑制了梨果实呼吸速率的上升。

如图3B所示，对照组果实乙烯生成速率呈下降趋势。室温下放置1 d，对照组的乙烯生成速率达到最高值（88.98 μg/（kg·min）），显著高于1-MCP处理组。随后呈现下降趋势，至5 d 时达到最低值（52.85 μg/（kg·min））。1-MCP处理组的乙烯生成速率在3 d时达到最高值（77.80 μg/（kg·min）），明显低于对照组的乙烯高峰值，随后变化不明显。这表明1-MCP抑制了乙烯的形成，推迟了乙烯高峰出现的时间。

2.4 1-MCP对‘Bartlett’梨抗氧化活性的影响

图4 1-MCP处理对‘Bartlett’梨抗氧化物质含量和抗氧化活性的影响Fig.4 Effect of 1-MCP treatment on antioxidants and antioxidant activity of ‘Bartlett' pears

由图4A可知，随着室温下放置时间的延长，对照组果实的DPPH自由基清除能力先增加后降低，在3 d达到最大值（5.39 mg/g），5 d时显著低于1-MCP处理组。1-MCP处理组果实在室温贮藏过程中DPPH自由基清除能力逐渐增加，室温下放置1 d时为4.63 mg/g，显著高于对照组（3.85 mg/g），5 d达到最高值（5.51 mg/g）。这说明1-MCP可以提高果实DPPH自由基清除能力。

如图4B所示，室温下梨果皮中的花青苷含量整体呈现上升的趋势。室温下放置1 d时对照组和1-MCP处理组的花青苷含量无显著差异，5 d时1-MCP处理组的花青苷含量达到11.74 mg/kg，显著高于对照组（8.90 mg/kg）。这表明1-MCP可提高果皮中花青苷水平。

从图4C、D中可以看出，室温下放置过程中，对照组果实中总黄酮和总酚含量总体呈现下降的趋势。室温下放置的前3 d，对照组和1-MCP处理组的总黄酮和总酚含量均呈下降趋势，且无显著差异；3 d后对照组的总黄酮和总酚含量持续下降，而1-MCP处理组呈上升趋势，5 d时1-MCP组的总黄酮和总酚含量分别达到9.15 mg/g和3.91 mg/g，均显著高于对照组。这表明1-MCP有利于货架后期总黄酮和总酚类物质含量的增加，从而能增强后熟过程中果实的抗氧化能力。

2.5 1-MCP对‘Bartlett’梨抗氧化酶活力和MDA含量的影响

图5 1-MCP处理对‘Bartlett’梨抗氧化酶活力和MDA含量的影响Fig.5 Effect of 1-MCP treatment on antioxidant enzyme activities and MDA content of ‘Bartlett' pears

APX、CAT和POD是生物体内重要的抗氧化酶，参与清除活性氧，从而提高生物体的抗逆性或延缓其衰老。从图5A、B可以看出，随着室温下放置时间的延长，梨果实中的APX、CAT活力均呈现下降的趋势。室温下放置1 d时，对照组的APX、CAT活力分别为164.01 U/（g·min）和48.42 U/（g·min），显著低于1-MCP处理组的194.93 U/（g·min）和72.91 U/（g·min）。至5 d时，对照组和1-MCP处理组的APX、CAT活力均差异显著，其中对照组的APX和CAT活力分别下降至83.25 U/（g·min）和22.65 U/（g·min），与1 d相比降幅分别为49.24%和53.22%；而1-MCP处理组5 d时APX和CAT活力分别为111.75 U/（g·min）和47.70 U/（g·min），降幅分别为42.67%和34.58%。这表明1-MCP处理显著提高了APX和CAT活力，减小了其下降幅度。

由图5C可知，室温下，对照组果实的POD活力呈现先升高后下降的趋势，而1-MCP处理组的POD活力呈持续增加趋势。室温下放置1 d时，对照组和1-MCP处理组的POD活力无显著差异，3 d时对照组的POD活力（11.36 U/（g·min））显著高于1-MCP处理组（8.81 U/（g·min））。3 d后对照组的POD活力下降，而1-MCP处理组的果实POD活力持续上升。5 d时，1-MCP处理组的POD活力为18.65 U/（g·min），显著高于对照组（8.02 U/（g·min））。这表明1-MCP处理可提高果实POD活力、推迟POD活力高峰出现时间、提高果实的抗氧化性。

从图5D可以看出，室温下梨果皮中MDA含量呈现增加趋势。室温下放置1 d，对照组和1-MCP处理组果皮中MDA含量处于较低水平，二者之间无显著差异。随后果皮中MDA含量呈现快速上升的趋势。室温下放置3 d和5 d时，对照组的MDA含量分别为4.89 mmol/g和5.40 mmol/g，1-MCP处理组分别为3.81mmol/g和3.74 mmol/g，显著低于同时期的对照组（P＜0.05）。这表明1-MCP处理显著抑制了MDA含量的增加。

3 讨 论

‘Bartlett’梨是西洋梨优良品种之一，后熟时果肉细腻、多汁、香味浓郁，受到消费者的喜爱。一般冷藏条件下，‘Bartlett’梨的贮藏期为3 个月，之后果实易发生虎皮病，商品价值降低[21]。本实验研究表明，冷藏前3 个月对照组和1-MCP处理组果实均没有虎皮病发生，冷藏4 个月后室温下放置5 d，对照组果实虎皮病病情指数为8.48%，1-MCP处理组无虎皮病发生。冷藏5 个月后对照组和1-MCP虎皮病发生指数急剧上升，其在室温下放置5 d后发病指数分别为71.36%和31.98%，失去了商品性。这表明，采前喷施1-MCP可以降低冷藏期间‘Bartlett’梨虎皮病病情指数，推迟虎皮病发生时间1 个月，延长了贮藏期。

虎皮病是一种生理性病害，其发生与果皮中α-法尼烯的氧化产物共轭三烯密切相关[22-23]。α-法尼烯合成需要3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的转录与翻译，该酶受乙烯的诱导[24]。1-MCP作为乙烯的竞争抑制剂可与乙烯受体结合，从而阻断乙烯信号的传递[25]。有研究也表明，1-MCP通过影响乙烯合成基因的表达减少乙烯的合成[26]。因此，1-MCP可通过降低贮藏期间乙烯合成或阻碍乙烯信号转导，抑制α-法尼烯合成，降低其氧化产物共轭三烯在果皮中的积累，从而减少虎皮病的发生。

有研究表明，虎皮病的发生也与果实的抗氧化能力有关，而果实的抗氧化能力与抗氧化物质含量和抗氧化酶活性有关[27-28]。α-法尼烯是一种半萜类物质，带有的共轭双键易自氧化形成H2O2和过氧化产物[29]。CAT、APX和POD是植物体内主要清除H2O2的酶类，其活性的增加可清除多余的H2O2，避免造成细胞膜的膜脂过氧化，从而抑制MDA含量的增加。类黄酮[30-31]、多酚[32-33]、花青苷[34-35]是重要的抗氧化物质，可直接清除活性氧，维持体内活性氧代谢平衡，避免对细胞结构的破坏。本研究结果表明1-MCP显著提高了货架后期果皮内花青苷、总黄酮和总酚的含量和DPPH自由基清除能力；同时1-MCP处理还能显著抑制CAT和APX活力的下降，提高POD活力，减少活性氧的积累，从而减缓果皮膜脂过氧化作用，抑制MDA含量增加，保持果皮细胞结构的完整性，抑制虎皮病的发生。