阿魏酸类似物对强的松诱导的小鼠氧化应激的影响

刘子微，朱建津,*，陈巍文，李浙烽

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.杭州康德权饲料有限公司，浙江 杭州 311107）

随着社会的发展，人们的压力越来越大，近年来，由压力过度导致的应激性疾病越来越受到重视。过度的应激会通过下丘脑-垂体-肾上腺皮质（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）轴分泌大量糖皮质激素而使机体的功能紊乱，同时产生大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[1]。当体内生成的ROS超过机体抗氧化防御系统的清除能力时，就会出现氧化应激，长期的氧化应激会使抗氧化防御功能衰减[2]。研究已证明抗氧化剂的摄入可以减缓氧化应激带来的危害[3]。

阿魏酸、姜黄素和谷维素这3 种天然提取物在抗氧化方面的作用已有报道，研究表明，它们的抗氧化能力主要归因于其清除自由基的能力，同时它们还能增强抗氧化酶活性来实现其抗氧化功能[4-6]。同时，在阿魏酸分子结构中，由于其自身存在亲水性的羟基与羧基，并且烷烃链相对较短，使其脂溶性较低，而姜黄素和谷维素虽然都有与阿魏酸相似的结构，但其都具有很好的脂溶性。这3 种物质的抗氧化能力是否会因此存在差异值得深入探讨。辅酶Q10也是一种常见的抗氧化剂，研究表明，外源性补充辅酶Q10可显著降低细胞的氧化应激水平[7-8]。

线粒体是ROS产生的主要场所[9]，过量的自由基又会攻击线粒体电子传递链，进而导致线粒体功能异常。线粒体功能障碍与心血管疾病、神经退行性疾病等多种疾病有关[10]。目前，线粒体已成为治疗疾病的一个新靶点[11]。抗氧化剂如果可以进入线粒体，就可以从源头上清除ROS，减少氧化应激带来的伤害。由于线粒体膜是磷脂双分子层结构，所以可以推测，脂溶性强的物质更容易进入线粒体。本研究初步探讨了是否是阿魏酸、姜黄素和谷维素的脂溶性不同导致了这3 种物质抗氧化效果存在差异。

强的松是一种糖皮质激素，大剂量注射可使小鼠HPA轴激素分泌紊乱，从而引起体内应激[12-13]。因此本实验以强的松诱导的氧化应激小鼠作为实验对象，在日粮中添加阿魏酸、姜黄素和谷维素，并且以辅酶Q10作为阳性对照，来研究其在小鼠体内起到抗应激、抗氧化和改善线粒体能量代谢的作用，为阿魏酸、姜黄素和谷维素在抗氧化方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

90 只7 周龄SPF级别ICR雄性小鼠，初始体质量为（30.29±0.92）g，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0003，购自上海斯莱克生物科技有限公司。

阿魏酸 江苏采薇生物技术有限公司；姜黄素广州东姿生物科技有限公司；谷维素 山西中诺生物科技有限公司；辅酶Q10 浙江新和成股份有限公司；强的松 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；小鼠促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）、小鼠促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、小鼠皮质酮（corticosterone，CORT）、小鼠乙酰辅酶A酶联免疫吸附检测试剂盒厦门慧嘉生物科技有限公司；过氧化氢酶（catalase，C AT）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、Mn-SOD试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒 南京建成生物工程研究所；总蛋白定量试剂盒、线粒体提取试剂盒、线粒体膜电位、NAD+/NADH检测 上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

5804R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗仪器仪表厂；多功能酶标仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；R686VLT超低温冷冻冰箱 美国Invetro公司；AB204-N电子天平、320 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；XB70制冰机 美国GRANT公司；恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与饲养

将90 只7 周龄雄性ICR小鼠适应性饲养一周后随机分为6 组：正常组、模型组、阿魏酸组、姜黄素组、谷维素组和阳性对照（辅酶Q10）组，每组15 只。随即，正常组肌肉每3 d注射一次生理盐水，其他组注射40 mg/kgmb强的松进行造模。正常组和模型组饲喂正常饲料，其他4 组每千克饲料中分别添加了40 mg的阿魏酸、姜黄素、谷维素和辅酶Q10。注射时间和饲养时间均为8 周。

1.3.2 糖水消耗实验

造模第6周进行糖水实验：实验前48 h，给小鼠双瓶饮水，一瓶为质量分数1%的蔗糖溶液，另一瓶为普通饮用水。24 h后，将小鼠禁水禁食24 h，之后再次给予小鼠双瓶饮水，记录水瓶质量，1 h后，通过称量饮水瓶的质量计算小鼠蔗糖溶液及普通饮用水的消耗量。小鼠对糖水的偏好程度按下式计算。

1.3.3 强迫游泳实验

造模第7周进行糖强迫游泳实验：将小鼠放入一个不透明的圆桶（高30 cm、直径50 cm）中，水深约10 cm，水温（25±1）℃，每次1 只小鼠。让小鼠在桶中游泳6 min，记录后4 min内小鼠的累计绝望状态（停止挣扎、仅露出鼻孔呼吸、处于漂浮状态）时间。

1.3.4 样品采集和测定

小鼠饲养8 周后，眼球取血入抗凝采血管中，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取上层血浆，－80 ℃保存待测。取肝脏、心脏、腿部肌肉、下丘脑和垂体加入预冷的生理盐水，匀浆制得100 g/L组织匀浆，4 000 r/min离心10 min后取上清液，用于氧化还原指标及蛋白质含量测定。其余组织液氮速冻后保存于－80 ℃待测。心脏、肝脏、腿部肌肉取出后立即称取100 mg于离心管中，冰浴上用磷酸盐缓冲液洗涤后剪碎，2 h内进行线粒体提取，加入40 μL线粒体存储液重悬后，测定蛋白质量浓度和抗氧化指标。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行正态分布分析和方差分析，结果以平均值±标准差表示，显著水平为P＜0.05，极显著水平为P＜0.01，采用GraphPad Prism 8.01软件作图。

2 结果与分析

2.1 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠体质量和行为的影响

表1 阿魏酸类似物对小鼠体质量的影响（n＝10）Table 1 Effects of ferulic acid analogs on body mass of mice (n= 10)

由表1可知，正常组小鼠体质量随时间延长而增长，而其余各组前期体质量下降，且与正常组有显著性差异（P＜0.05），而造模一周后，体质量有所回升，之后则呈波动变化。其中，辅酶Q10组小鼠体质量在后期较初始体质量有所回升，而模型组和阿魏酸组体质量总体有所下降，姜黄素组和谷维素组波动较为平缓。体质量与能量代谢相关，体质量变化结果表明，氧化应激短期会造成小鼠体质量持续降低，到后期体质量呈波动变化。辅酶Q10能够在一定程度上缓解氧化应激小鼠体质量的降低，姜黄素和谷维素较模型组来说，也有一定的作用，但是作用不明显。阿魏酸对此没有明显影响。

表2 阿魏酸类似物对小鼠糖水偏好程度的影响Table 2 Effects of ferulic acid analogs on sucrose preference in mice

由表2可知，模型组糖水偏好程度显著低于正常组（P＜0.05），阿魏酸组接近于模型组，与正常组有显著差异（P＜0.05）；与模型组相比，谷维素组和姜黄素组有所提高，但差异不显著（P＞0.05）；辅酶Q10组与正常组最接近，且与模型组有显著差异（P＜0.05）。糖水的偏好程度可以用来反映应激造成小鼠的抑郁程度[14]。实验结果表明，应激使小鼠的糖水偏好程度降低，4 种抗氧化剂对提高小鼠糖水偏好程度效果：阿魏酸组＜姜黄素组＜谷维素组＜辅酶Q10组。这说明阿魏酸没有逆转小鼠的应激状态；姜黄素和谷维素对逆转小鼠应激有帮助，但是效果不显著；辅酶Q10对小鼠应激状态有显著改善效果。

表3 阿魏酸类似物对小鼠强迫游泳绝望状态时间的影响Table 3 Effects of ferulic acid analogs on cumulative desperation time in mice during forced swimming experiment

由表3可知，模型组小鼠绝望状态时间显著长于正常组（P＜0.05），姜黄素组、谷维素组和辅酶Q10组绝望状态时间显著短于模型组（P＜0.05），姜黄素组与正常组最接近，阿魏酸组较模型组也有降低，但差异不显著（P＞0.05）。小鼠强迫游泳实验中的绝望状态时间反映了小鼠受应激的程度[15]。实验结果表明，4 种抗氧化剂缩短小鼠绝望状态时间的效果依次为阿魏酸组＜谷维素组＜辅酶Q10组＜姜黄素组。并且姜黄素、谷维素和辅酶Q10对改善小鼠应激状态有显著作用，阿魏酸没有逆转小鼠的应激状态，其中姜黄素的效果最好。

2.2 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠相关应激指标的影响

由图1可知，模型组下丘脑CRH、垂体ACTH和血浆CORT含量显著高于正常组（P＜0.05）。阿魏酸组小鼠下丘脑CRH和垂体ACTH含量显著低于模型组（P＜0.05）。姜黄素组、谷维素组和辅酶Q10组显著低于模型组（P＜0.05）。谷维素组和辅酶Q10小鼠血浆CORT含量显著低于模型组（P＜0.05），阿魏酸组和姜黄素组血浆CORT较模型组有所降低，但无显著差异（P＞0.05）。应激会使HPA轴被激活，小鼠体内CRH、ACTH和CORT分泌增加[16]。实验结果表明，阿魏酸、姜黄素、谷维素和辅酶Q10都能够显著降低小鼠应激状态下下丘脑CRH和ACTH的含量。谷维素和辅酶Q10显著降低小鼠血浆CORT的含量。并且它们的作用效果依次为阿魏酸组＜姜黄素组＜谷维素组＜辅酶Q10组。

图1 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠HPA轴激素的影响Fig.1 Effects of ferulic acid analogues on hypothalamic-pituitary-adrenal axis hormones in mice with prednisone-induced oxidative stress

2.3 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠体内氧化还原状态的影响

图2 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠体内CAT活力的影响Fig.2 Effects of ferulic acid analogues on CAT activity in mice with prednisone-induced oxidative stress

由图2可知，模型组小鼠体内CAT活力显著低于正常组。谷维素组和辅酶Q10组血浆CAT活力显著高于模型组（P＜0.05），阿魏酸组和姜黄素组也高于模型组，但无显著差异（P＞0.05）。谷维素组和辅酶Q10组肝脏和肌肉CAT活力显著高于模型组（P＜0.05）。阿魏酸组和姜黄素组肌肉、肝脏CAT活力较模型组高，但无显著差异（P＞0.05）。模型组肝脏CAT活力显著低于辅酶Q10组（P＜0.05），阿魏酸组、姜黄素组和谷维素组与模型组比有所提高，但无显著差异（P＞0.05）。CAT能够催化体内过氧化氢分解成氧和水的酶，来减轻过氧化氢带来的伤害[17]。实验结果表明，氧化应激使小鼠体内CAT活力降低，这4 种抗氧化物质均能够改善此现象，但效果也存在差异：阿魏酸＜姜黄素＜谷维素＜辅酶Q10。综合来说，辅酶Q10提高CAT活力效果最显著。

图3 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠体内MDA含量的影响Fig.3 Effects of ferulic acid analogues on MDA contents in mice with prednisone-induced oxidative stress

由图3可知，模型组小鼠体内MDA含量显著高于正常组。正常组血浆MDA含量显著低于阿魏酸组和姜黄素组（P＜0.05）。辅酶Q10组心脏MDA含量显著低于模型组（P＜0.05），阿魏酸、姜黄素和谷维素组相比模型组有所减少，但总体无显著差异（P＞0.05）。模型组肌肉MDA含量显著高于姜黄素组、谷维素组和辅酶Q10组（P＜0.0 5），阿魏酸组与模型组无显著差异（P＞0.05）。谷维素组和辅酶Q10组肝脏MDA含量显著低于模型组（P＜0.05），阿魏酸组和姜黄素组较模型组有所减少，但无显著差异（P＞0.05）。MDA是脂质过氧化物代谢过程中形成的小分子产物，MDA含量可以用来衡量脂质过氧化的程度[18]。实验结果表明，氧化应激会造成体内MDA含量增加，综合来看，辅酶Q10对此改善作用最明显，谷维素改善作用接近于辅酶Q10，阿魏酸和姜黄素也有一定的作用，但是效果不显著。

图4 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠组织总SOD活力的影响Fig.4 Effects of ferulic acid analogues on total SOD activity in tissues of mice with prednisone-induced oxidative stress

由图4可知，模型组小鼠体内SOD活力显著低于正常组。阿魏酸、姜黄素、谷维素和辅酶Q10组心脏和肌肉总SOD活力显著高于模型组（P＜0.05）。模型组肝脏总SOD活力显著低于谷维素组和辅酶Q10组（P＜0.05），阿魏酸组和姜黄素组相比模型组有所提高，但差异不显著（P＞0.05）。SOD活力反映了组织细胞清除超氧阴离子自由基的能力。实验结果表明，氧化应激时小鼠SOD活力降低，谷维素和辅酶Q10能够显著提高总SOD活力，阿魏酸和姜黄素在心脏和肌肉组织中提高SOD活力效果不明显。

2.4 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠线粒体内氧化还原状态的影响

图5 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠线粒体Mn-SOD活力的影响Fig.5 Effects of ferulic acid analogues on mitochondrial Mn-SOD activity in mice with prednisone-induced oxidative stress

由图5可知，模型组小鼠线粒体Mn-SOD活力显著低于正常组。阿魏酸、姜黄素、谷维素和辅酶Q10组心脏和肌肉Mn-SOD活力显著低于正常组（P＜0.05），相比模型组有所提高，但差异不显著（P＞0.05）。谷维素组和辅酶Q10组肝脏线粒体Mn-SOD活力显著高于模型组（P＜0.05），阿魏酸组和姜黄素组高于模型组，但无显著差异（P＞0.05）。真核细胞SOD包含Cu/Zn-SOD、Mn-SOD，其中Mn-SOD主要存在于线粒体中，所以Mn-SOD更能体现线粒体的超氧阴离子自由基清除能力[19]。实验结果表明，氧化应激时小鼠线粒体Mn-SOD活力降低，但是阿魏酸和姜黄素对提高Mn-SOD活力没有明显效果，谷维素和辅酶Q10明显提高了肝脏线粒体Mn-SOD活力。

图6 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠组织线粒体膜电位的影响Fig.6 Effects of ferulic acid analogues on mitochondrial membrane potential in mice with prednisone-induced oxidative stress

由图6可知，模型组小鼠线粒体膜电位显著小于正常组（P＜0.05）。姜黄素组、谷维素组和辅酶Q10组心脏膜电位显著大于模型组（P＜0.05），阿魏酸组与模型组相比有所提高但无显著差异（P＞0.05）。肌肉线粒体膜电位依次为阿魏酸组＜姜黄素组＜谷维素组＜辅酶Q10组，其与正常组和模型组都没有显著差异（P＞0.05）。阿魏酸组和姜黄素组肝脏线粒体膜电位高于模型组，但无显著差异（P＞0.05）；模型组显著低于谷维素组和辅酶Q10组（P＜0.05）。线粒体氧化磷酸化过程形成的膜电位，对维持线粒体内外物质交换具有重要意义，被用来评价线粒体功能[20]。实验结果表明：氧化应激使线粒体膜电位降低。谷维素和辅酶Q10对提高线粒体膜电位效果比较明显，阿魏酸和姜黄素的效果不明显。

图7 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠线粒体内NADH和NAD+比值的影响Fig.7 Effects of ferulic acid analogues on mitochondrial NADH/NAD+ratio in mice with prednisone-induced oxidative stress

由图7可知，模型组线粒体NADH/NAD+显著小于正常组。辅酶Q10组心脏和肝脏线粒体NADH/NAD+显著大于模型组（P＜0.05），阿魏酸、姜黄素和谷维素组较模型组有所提高，但无显著差异（P＞0.05）。阿魏酸、姜黄素、谷维素和辅酶Q10肌肉线粒体NADH/NAD+都高于模型组，但与模型组和正常组均无显著差异。当线粒体功能受损时，能量供给不足，NADH过量且NAD+缺乏[21]。实验结果表明，辅酶Q10对提高心脏和肝脏NADH/NAD+比值有一定的效果，其他3 种物质对提高线粒体NADH/NAD+比值作用不显著。

图8 阿魏酸类似物对强的松诱导氧化应激小鼠线粒体内乙酰辅酶A含量的影响Fig.8 Effects of ferulic acid analogues on mitochondrial acetyl-CoA content in mice with prednisone-induced oxidative stress

由图8可知，模型组小鼠线粒体内乙酰辅酶A含量显著小于正常组（P＜0.05）。姜黄素组、谷维素组和辅酶Q10组心脏线粒体乙酰辅酶A含量显著高于模型组（P＜0.05），阿魏酸组较模型组有所提高，但无显著差异（P＞0.05）。辅酶Q10组肌肉线粒体乙酰辅酶A含量显著大于模型组（P＜0.05），阿魏酸组、姜黄素组和谷维素组与模型组相比有所提高但无显著差异（P＞0.05）。模型组肝脏线粒体内乙酰辅酶A含量显著低于谷维素组和辅酶Q10组（P＜0.05），阿魏酸组和姜黄素组高于模型组，但无显著差异（P＞0.05）。乙酰辅酶A是能量代谢重要中间产物，是衡量线粒体功能的重要指标[22]。实验结果表明：氧化应激使线粒体内乙酰辅酶A含量降低，谷维素对此有一定的改善作用，辅酶Q10提高乙酰辅酶A含量效果显著，而阿魏酸和姜黄素有一定的作用，但效果不显著。

3 讨 论

当机体受到应激时，糖皮质激素大量分泌，代谢发生异常而产生大量的ROS，若抗氧化物质不足，则会导致促氧化剂与抗氧化剂之间失衡，使机体处于氧化应激状态[23]。氧化应激会破坏生物大分子的结构，并进一步引起细胞凋亡和组织损伤，这与很多病理过程相关[24-25]。有研究表明，抗氧化剂的补充可以帮助一些疾病的治疗[26-28]。

长期处在应激状态下或应激过于强烈则会造成抑郁，本研究采用强迫游泳和糖水偏好程度两个行为学实验来判断小鼠的抑郁程度。结果表明，阿魏酸类似物和辅酶Q10能够缓解应激造成的小鼠抑郁程度。谢伟彬[29]和史楠楠[30]等的研究已证明，阿魏酸和姜黄素提高了抑郁模型大鼠的糖水偏好程度并缩短了强迫游泳的绝望状态时间，与本实验的研究结果一致。

SOD和CAT等抗氧化酶是防御ROS的第一道防线，其活性有助于对抗ROS对细胞的攻击。He Huijun等[31]发现，体内的抗氧化酶受氧化应激的影响，含量会大幅下降，进而导致器官功能的衰退。Vnukov等[32]发现，氧化应激会加大脂质过氧化程度产生大量MDA。本研究中，氧化应激模型组小鼠体内抗氧化酶活力下降且过氧化物含量增加，与前人研究结果一致。在代谢过程中，自由基的堆积是一种正常现象，研究发现，若充分地补充外源性抗氧化剂，就能提升体内SOD、CAT等抗氧化酶的活力，从而有效抑制自由基过量造成的氧化损伤[33-34]。本研究中阿魏酸类似物和辅酶Q10对提高抗氧化物酶的活力也有相同的作用。

线粒体是机体进行能量代谢的主要部位，同时也是ROS的产生和攻击的主要靶点。很多原因会导致线粒体功能失衡，如疾病、衰老、基因突变等[35-36]。Requardt等[37]发现，氧化应激对线粒体主要表现为线粒体膜电位降低，氧化磷酸化等能量代谢过程受损。NADH和NAD+的氧化还原状态和乙酰辅酶A的产生是线粒体氧化磷酸化的关键节点[38]。研究表明，细胞线粒体氧化损伤使电子呼吸链受到抑制，显著减少了NADH/NAD+比值，降低乙酰辅酶A水平[39-40]。本研究中氧化应激使小鼠线粒体氧化磷酸化过程受损，而阿魏酸类似物和辅酶Q10的摄入提高了NADH/NAD+的比值和乙酰辅酶A的含量，改善了这一现象。在真核细胞的线粒体中，SOD的主要存在类型是Mn-SOD，所以常用Mn-SOD的活力来反映线粒体的超氧阴离子自由基清除能力。Cao Yang等[41]的研究表明，Mn-SOD含量的提高可以保护线粒体结构完整。本研究中，阿魏酸等抗氧化物质的摄入提高了线粒体内Mn-SOD的含量，并且改善了线粒体的能量代谢受损的情况，这与已有研究对Mn-SOD与线粒体关系的观点一致。由于线粒体是ROS产生的源头，抗氧化剂提高了线粒体内抗氧化酶的活力和改善线粒体能量代谢功能，进而减轻了氧化应激对机体组织器官的危害。

本研究中，阿魏酸等抗氧化剂的补充改善了氧化应激造成的体内抗氧化物酶活力降低和线粒体能量代谢功能失衡等现象，同时也发现不同的物质的抗氧化和对线粒体的保护作用有差异。在本实验条件下，脂溶性强的物质，如谷维素和辅酶Q10，其对线粒体的保护作用相比水溶性物质阿魏酸和脂溶性较低物质姜黄素强。但是，目前没有直接证据证明其是否进入线粒体，还有待后续实验进行讨论。

综上所述，阿魏酸、姜黄素和谷维素对强的松诱导的小鼠氧化应激状态有一定的改善作用，但是不同的抗氧化剂的抗氧化效果不尽相同，本研究表明，3 种物质的抗氧化效果依次为阿魏酸＜姜黄素＜谷维素，其中谷维素比阿魏酸和姜黄素的效果要强，辅酶Q10 作为阳性对照，抗氧化效果最好，谷维素的效果接近辅酶Q10。此差异是否与其脂溶性以及是否进入线粒体发挥作用有关联还需要进一步研究。