酸枣仁提取物与茶氨酸复合配方对睡眠的改善作用

陈琼，陈朋，李俊颖，徐旻珺

(仙乐健康科技股份有限公司，广东 汕头，515041)

失眠是最常见的睡眠障碍疾病，我国每年有超过1/3的成年人睡眠质量低下[1]。目前用于治疗失眠的药物有很多，如唑吡坦、佐匹克隆等。镇静催眠药物已经发展到了第3代，疗效不断提升，但使用催眠镇静药物会产生乏力、头晕等不可避免的副作用[2]，以食疗代替药物改善睡眠质量的方法受到越来越多的关注。文献报道酸枣仁、茶氨酸均有改善睡眠的作用[3-4]。酸枣仁是临床常用于治疗失眠的一味中药，最早用于汉代名医张仲景所写的《金匮要略·血脾虚劳病脉证》，具有清热养血、安神除烦的功效[5]。酸枣仁中的有效成分已经被学者所发现，对其改善睡眠的作用机制的研究也越来越深入。L-茶氨酸是一种在20世纪90年代由日本科学家发现于茶叶中的非蛋白质游离氨基酸，具有改善睡眠的功效[6]。由于酸枣仁已被录入药食同源名单，茶氨酸被批准为新资源食品，作为食品原料安全性佳，必然会受到市场广泛关注。目前，关于酸枣仁改善睡眠的研究很多，但尚未见将酸枣仁与茶氨酸联用的报道。本研究在对这2种原料研究的基础上，通过动物实验探寻酸枣仁与茶氨酸联用的合适用量，并探究它们与小鼠部分血液和脑组织指标的关系，为助眠产品的研发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸枣仁提取物，杨凌萃健生物工程技术有限公司；茶氨酸，湖南金农生物资源股份有限公司；戊巴比妥钠、巴比妥钠，德国Sigma公司；小鼠色氨酸、小鼠5-羟色胺、小鼠β-内啡肽ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

一次性注射器，江西洪达医疗器械集团；XS1003S型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；Centrifuge 5425离心机，德国Eppendorf公司；Synergy H1酶标仪，美国Biotek公司。

1.3 动物与分组

SPF级Balb-c健康雄性小鼠120只(8周龄，18～20 g)，小鼠随机分为4批，每批30只。各批间体质量无统计学差异。第1批用于直接睡眠以及延长戊巴比妥钠睡眠时间实验;第2批用于戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验;第3批用于缩短巴比妥钠睡眠潜伏期时间实验;第4批用于小鼠血液中色氨酸、5-羟色胺含量，脑组织中5-羟色胺、β-内啡肽含量的测定。

1.4 配方与剂量

每批小鼠随机分成3组，每组各10只小鼠，分为空白对照组，低剂量组和高剂量组。空白对照组以与实验组同体积蒸馏水进行灌胃；低剂量组为酸枣仁提取物105 mg/(kg·d)，茶氨酸58 mg/(kg·d)，高剂量组为酸枣仁提取物158 mg/(kg·d)，茶氨酸87 mg/(kg·d)，依据剂量分别配制灌胃液，灌胃体积为0.2 mL/10 g，每日1次。

1.5 实验方法

1.5.1 直接睡眠实验

将第1批小鼠按1.4中方法进行实验，连续给样品30 d，末次以动物的翻正反射消失为入睡指标观察小鼠睡眠情况。

1.5.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

将用于直接睡眠实验的各组小鼠在末次给受试物后20 min经腹腔注射戊巴比妥钠0.2 mL/20 g，以动物的翻正反射消失为指标，观察样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。

1.5.3 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

将第2批小鼠按1.4中方法进行实验，连续给样品30 d，末次给样品20 min后经腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/(kg·d)，以动物的翻正反射消失为指标，观察30 min内小鼠睡眠情况。

1.5.4 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

将第3批小鼠按1.4中方法进行实验，连续给样品30 d后。末次给样品20 min后经腹腔注射巴比妥钠0.2 mL/20 g，以翻正反射消失为指标，观察样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。

1.5.5 小鼠血液中色氨酸、5-羟色胺含量检测

将第4批小鼠按1.4中方法进行实验，连续给样品30 d后，将小鼠处死后取血，放置1 h待血液凝固，5 000 r/min下离心10 min,得到血清，严格按照小鼠色氨酸、小鼠5-羟色胺ELISA检测试剂盒说明书方法，对小鼠血液中色氨酸、5-羟色胺含量进行检测。

1.5.6 小鼠脑组织5-羟色胺、β-内啡肽含量检测

将1.5.5中实验小鼠脑组织取出，参照杜正彩等[7]的方法制成匀浆液进行离心后备用，严格按照小鼠5-羟色胺、小鼠β-内啡肽ELISA试剂盒说明书方法，对小鼠脑组织中5-羟色胺，β-内啡肽含量进行测定。

1.6 数据处理与分析

采用SAS 20.0软件进行数据分析，延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验、小鼠血液中色氨酸、5-羟色胺含量和脑组织5-羟色胺、β-内啡肽含量的组间显著性比较采用单因素方差分析，数据以“均值±标准差”表示。戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验的组间显著性比较采用卡方检验分析。

2 结果与分析

酸枣仁提取物与茶氨酸复合配方作用于小鼠的各项实验与分析如下文所示。

2.1 对小鼠直接睡眠的影响

3组小鼠在给予样品之后均未出现翻正反射消失的现象，表明酸枣仁提取物与茶氨酸复合配方高低剂量组均无直接睡眠作用。

2.2 对戊巴比妥钠诱导睡眠实验小鼠睡眠时间的影响

延长戊巴比妥钠睡眠时间实验方法结果如图1-a所示，与对照组相比，在经戊巴比妥钠诱导后，低剂量组小鼠睡眠时间并无增加，高剂量组小鼠睡眠时间较对照组显著增长(P<0.01)。

2.3 对戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验小鼠入睡率的影响

戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验结果如图1-b所示，对照组入睡发生率仅为10%。与对照组相比，高低剂量组均显著提升了小鼠的入睡发生率，高剂量组入睡发生率上升尤为明显(P<0.01)。

2.4 对巴比妥钠实验小鼠睡眠潜伏期时间的影响

巴比妥钠睡眠潜伏期实验结果如图1-c所示，与对照组相比，低剂量组小鼠睡眠潜伏时间有缩短趋势，但是不具有统计学上的显著性，高剂量组小鼠睡眠潜伏时间则显著缩短(P<0.01)。

2.5 对小鼠体质量的影响

对3项实验中高低剂量组小鼠在0、7、14、21、30 天进行体质量测量后进行统一分析，结果如表1所示。实验前各组小鼠初始体质量无明显差异(P>0.05)，在给予样品后，各组小鼠体质量也不呈现显著性差异(P>0.05)，表明高、低剂量组均对小鼠体质量无明显影响。

2.6 对小鼠血液指标(色氨酸、5-羟色胺)的影响

小鼠血液中色氨酸、5-羟色胺含量如图2所示，与对照组相比，在灌胃酸枣仁提取物茶氨酸复合配方30 d后，低剂量组血清色氨酸含量有增加趋势，但不具有显著性；高剂量组血清色氨酸含量显著提高(P<0.05)。此外，高低剂量组血液中5-羟色胺的含量与对照组相比并无显著差异。

a-延长戊巴比妥钠睡眠时间;b-戊巴比妥钠阈下剂量实验小鼠入睡率;c-巴比妥钠实验睡眠潜伏期时间图1 酸枣仁提取物与茶氨酸复合配方对小鼠睡眠的影响Fig.1 Effect of Semen Ziziphi Spinosae extract and theanine compound formula on the sleep quality of mice 注：*表示与对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)；**表示与对照组相比，具有显著性差异(P<0.01)(下同)

表1 酸枣仁提取物与茶氨酸复合配方对小鼠体质量的影响 单位：g

2.7 对小鼠脑组织指标(5-羟色胺、β-内啡肽)的影响

小鼠脑组织中5-羟色胺、β-内啡肽含量如图3所示。与对照组相比，给予样品后低剂量组与高剂量组小鼠脑组织中5-羟色胺的含量均显著升高(P<0.01)，且具有一定的量效关系。与之相反，在服食样品后，与对照组相比，高低剂量组小鼠脑组织中β-内啡肽含量均显著性降低，且高剂量组更具显著性(P<0.01)。

a-血清色氨酸;b-血清5-羟色胺图2 酸枣仁提取物-茶氨酸对小鼠血液中色氨酸、 5-羟色胺的影响Fig.2 Effect of Semen Ziziphi Spinosae extract and theanine on tryptophan and 5-hydroxytryptamine in mouse blood

a-5-羟色胺;b-β-内啡肽图3 酸枣仁提取物-茶氨酸对小鼠脑组织中 5-羟色胺和β-内啡肽的影响Fig.3 Effect of Semen Ziziphi Spinosae extract and theanine compound formula on 5-hydroxytryptamine and β-endorphin in mouse brain

3 结论与讨论

睡眠-觉醒的机制是一个十分复杂的过程，受到多种因素的调控[8]，其中色氨酸在诱导睡眠的机制中起着重要的作用。色氨酸在血液中多以与白蛋白结合的形态存在，然而血液中的游离脂肪酸也竞争同样的结合位点。当血浆中游离脂肪酸水平升高时，会导致色氨酸与白蛋白分离，进而使血液中游离色氨酸含量上升。过量的游离色氨酸搭乘L-氨基酸转运蛋白穿过血脑屏障进入大脑，之后分别通过2条路径诱导睡眠：(1)合成5-羟色胺，当脑内5-羟色胺的浓度升高，就会使机体产生疲劳感和睡意，更容易进入睡眠状态[9]，同时5-羟色胺作为褪黑素的前体也会促进褪黑素的形成[10]，褪黑素是一种调节生物节律的激素，常用作治疗睡眠障碍；(2)激活色氨酸-犬尿酸通路，与神经元胶质细胞和神经元突触上的色氨酸、犬尿酸受体结合，诱发神经性疲劳，最终达到诱导睡眠的目的[11]。酸枣仁作为一种临床上治疗失眠的中药，包含多种活性成分，其中脂肪酸种类达41种，含量达32%，因此服用酸枣仁可引起瞬时的血浆游离脂肪酸浓度升高[12-13]，进而使色氨酸和白蛋白解离，上调血浆色氨酸浓度。与此相一致，本文结果也显示高剂量组可显著升高小鼠血液中色氨酸的浓度(图2-a)，进而上调脑中5-羟色胺浓度(图3-a)，且与剂量呈现出正相关关系。同样，WANG等[14]发现酸枣仁中斯皮诺素能显著抑制5-HT1A激动剂，并作为5-HT1A受体拮抗剂延长大鼠的睡眠时间；LIANG等[15]研究发现酸枣仁皂苷成分能显著提高小鼠额叶皮层和海马中的5-羟色胺水平，与本实验相一致。

实验结果还证明，酸枣仁提取物与茶氨酸联用，在剂量低时在延长小鼠睡眠时间和减少睡眠潜伏时间方面均无改善的趋势，只增加了入睡率。在剂量高时则显现出明显的改善睡眠作用。茶氨酸的结构与谷氨酸很相似，能在神经系统中与谷氨酸受体进行竞争性结合[16]，有研究表明，茶氨酸能促进大脑中特别是纹状体多巴胺的释放[17]，之后一部分茶氨酸会被分解成谷氨酸进入血液循环，另一部分则成为合成γ-氨基丁酸的原料[18]。但是，从李靓等[19]的实验结果得知，当茶氨酸剂量为50 mg/(kg·d)时，也不体现出改善睡眠效果。同样，配方中所用酸枣仁量的不同，对小鼠睡眠的干预效果也有很大的差异[20-21]。本实验中低剂量组酸枣仁提取物用量为105 mg/(kg·d)，茶氨酸剂量为58 mg/(kg·d)，无法达到改善睡眠的效果。此外，本实验中小鼠大脑中β-内啡肽的浓度随着酸枣仁提取物和茶氨酸剂量的升高而降低(图3-b)。β-内啡肽的浓度与睡眠有关，有文献报道猫服用β-内啡肽后会出现失眠症状[22]，也有人体实验证实体内β-内啡肽的减少，能够改善其失眠症状[23]，不过尚未有文献探究酸枣仁或者茶氨酸与β-内啡肽间的联系，从结果推测,酸枣仁与茶氨酸联用可降低脑组织中β-内啡肽的浓度，并且具有量效关系，对改善小鼠睡眠也有一定作用。

综合上述实验结果，酸枣仁提取物与茶氨酸复合配方高剂量组显著延长戊巴比妥钠睡眠时间、增加戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验入睡率和减少巴比妥钠睡眠潜伏实验睡眠潜伏时间,且无直接睡眠作用。根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》[24]改善睡眠评价方法，酸枣仁提取物与茶氨酸复合配方在酸枣仁提取物158 mg/(kg·d)、茶氨酸87 mg/(kg·d)时，能显现出良好的协同效果，具有明显的改善睡眠作用，这种作用可能是通过提高血浆色氨酸浓度以及脑中色氨酸代谢产物含量和降低β-内啡肽含量来实现的。