蛋白界面膜及其评价方法研究进展

卢筠梦,赵雪,徐幸莲

(南京农业大学 食品科学与技术学院，肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏 南京，210095)

市面上许多常见的加工食品都是以乳状液形式存在的多相分散体系，分散体由分散在水相中的油滴组成，如奶油、冰淇淋、酱汁、饮料等。蛋白质是这些加工食品中的重要组分，是食品加工过程中良好的绿色天然乳化剂。食品中的蛋白质大多是两亲性分子，如酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、明胶、肌原纤维蛋白和豌豆蛋白等[1]，分子表面同时含有极性和非极性基团，既能表现良好的水溶性又能在油相中分散，因此在合适条件下能够吸附到水油界面，包裹乳化过程中形成的油滴，形成物理屏障，防止乳滴间絮凝和聚结发生[2]。通过这种方式在水油界面形成的吸附膜具有黏弹性，称为蛋白界面膜(protein interfacial film, PIF)。PIF可以降低油滴表面的界面张力，抵抗一定的机械作用力，PIF中蛋白分子间的静电斥力和由表面分子伸展引起的空间排阻效应是维持乳液稳定性的主要作用力[3]。因此，PIF特性与乳液的稳定性紧密相关，良好的乳液稳定性有利于维持产品的加工特性和质地，这也使得蛋白质界面结构和乳状液性质多年来被食品胶体和界面科学领域广泛关注。图1展示了几种食品PIF的模型示意图。

掌握水油界面上蛋白界面膜的物化特性有助于了解蛋白大分子在水油界面的吸附规律，能够用于评价、表征和预测蛋白乳液稳定性，并为优化蛋白乳化能力提供理论支持。因此，研究者们采用了多种分析方法和技术手段用以评价表征PIF。本文简要概述了乳液PIF的形成机制以及影响其特性的内源和外源因素，系统综述了目前用于研究PIF特性的新型手段和方法，包括微观成像技术、热力学技术、光谱技术和界面流变技术等，为揭示乳液PIF的形成规律，解析PIF对外界因素的响应机制提供定量和定性的分析方法，为建立PIF与乳液稳定性关系，改善蛋白乳化产品品质提供新思路。

a-不规则蜷曲状蛋白质;b-球状蛋白质;c-多种蛋白质络合; d-多层蛋白质膜图1 食品乳液中的蛋白质界面膜Fig.1 Protein interfacial films in food emulsions

1 蛋白质界面膜

1.1 PIF的形成机制

PIF的形成可分为3个阶段：第1阶段蛋白质扩散；第2阶段蛋白质在界面吸附，通过抵抗切向剪切来防止液滴膨胀破裂，此时蛋白分子结构发生改变，体系自由能降低；第3阶段蛋白分子在界面发生结构重排、交联并固化成膜防止液滴絮凝，此时界面网络结构形成，疏水基团充分暴露，蛋白分子间相互作用增强[4]。

蛋白分子的典型结构包括球状及柔软的无规则蜷曲状(图1)，吸附到水油界面后为获得较低的体系自由能其构象会发生明显变化，大多数蛋白质失去三级结构，但保留大量二级结构，导致蛋白质在界面上的三维结构和柔韧性与在溶液中大不相同。例如，许多球状蛋白吸附到水油界面后展开，暴露出非极性和含硫氨基酸，蛋白间疏水作用增加，二硫键形成[5]。尽管有关蛋白质吸附到乳液界面阶段具体的构象转变，及其对蛋白乳液稳定性的影响尚未充分揭示，但仍有许多研究讨论其中的变化规律。当蛋白质吸附到乳液界面时，受限的物理空间迫使蛋白质呈现出最紧密的二级结构，通常是α螺旋或β折叠[6]。蛋白质局部渗透进入油相的最简单的构象形式是α螺旋，因此尽管部分蛋白(如牛血清蛋白)吸附到水油界面后α螺旋含量下降，但蛋白质的二级结构仍然主要由螺旋结构主导。β折叠则是蛋白质在水油界面聚集的标志，天然蛋白在吸附界面受氢键和疏水作用的诱导形成β折叠易于蛋白质聚集[7]。此外，水油界面蛋白质吸附的主要热力学驱动力是油相中的非极性侧链对蛋白质疏水残基的相似相溶[8]，蛋白质在界面上的构象变化受油相的极性(界面张力γ)影响，吸附在极性较低的油相表面的蛋白质更容易发生构象改变，如β乳球蛋白在正十四烷/水界面(γ=53 mN/m)比在橄榄油/水界面(γ=29.5 mN/m)吸附更紧密[9]，这是因为低极性油相在蛋白吸附时更易诱导产生非天然的α螺旋，引起吸附蛋白结构重排。巯基向二硫键转化有利于吸附蛋白聚集成膜，部分天然蛋白，如乳清分离蛋白和肌原纤维蛋白，巯基埋藏在分子内部，这些蛋白经吸附、解折叠后活性巯基暴露，蛋白分子间通过二硫键交联成膜[10]。因此，含有丰富巯基的半胱氨酸残基有利于稳定PIF的结构，对水油界面吸附的蛋白质的构象重排有显著影响，对于没有巯基或巯基含量较少的混合蛋白质，则主要通过疏水相互作用和氢键来稳定PIF中蛋白质间的相互作用[11]。

1.2 影响PIF特性的因素

一般来说，PIF复杂结构的形成是分子间引力和斥力微妙平衡的结果，包括静电作用力、离子键、范德化力、氢键、疏水效应和构象熵引起的空间排阻等[12]。产生强烈排斥相互作用的PIF能更好地抑制液滴聚集，维持乳液稳定，最主要的稳定机制就是静电斥力作用和空间排阻作用。静电斥力是一种长程相互排斥作用，当PIF包覆的液滴携带同种电荷时，液滴间存在静电斥力，这种相互作用的强度通常随着界面层的厚度和亲水性的增加而增加[13]。空间排阻则是一种短程相互排斥作用，产生于2个邻近液滴表面PIF的重叠，其相互作用的强度也随着PIF厚度和亲水性的增加而增加[14]。相比静电斥力，空间排阻由于不易受环境干扰而更稳定。因此，任何打破上述吸引力与斥力平衡或对2种稳定作用力产生影响的因素均会影响PIF特性。

影响PIF特性的内源因素很多，包括蛋白质的组成和种类、表面疏水性、蛋白浓度和电荷特性等。在PIF形成过程中，膜蛋白的构象极大地受到其氨基酸残基分布的限制。通常，蛋白中含有大比例亲水性氨基酸残基时呈现细长的棒状；当其中含有大比例疏水残基时，蛋白分子倾向于呈现球状。一旦球状蛋白吸附到水油界面就开始解折叠暴露更多的氨基酸残基，随后形成横向的蛋白间相互作用，因此球状蛋白形成的PIF厚度较小且表面活性较高[15]。对于不同蛋白质，形成的PIF和稳定液滴的方式也存在细微差异，例如球状蛋白β-乳球蛋白和α-乳白蛋白形成薄而致密的PIF，主要通过静电斥力来稳定乳液液滴；而酪蛋白则形成厚而分散的PIF，通过空间排阻和静电斥力来防止乳液絮凝[3]。表面疏水性在PIF形成的第1阶段影响蛋白的吸附速率。天然状态的蛋白疏水区域大部分埋藏在分子内部，但在PIF形成的第2、3阶段，在疏水区域脱水的熵增驱动下，蛋白的高级结构发生改变，结构重排使得疏水残基尽可能地暴露在油相中。蛋白浓度对PIF的影响主要体现在第1阶段，由浓度梯度驱动的扩散控制吸附动力学可以用Ward-Tordai模型描述，如公式(1)所示。

(1)

式中：kD，扩散速率；π，界面表面压力(界面张力与溶液差)；c0，体相中的蛋白浓度；k，波尔兹曼常数；T，绝对温度；D，蛋白扩散系数。

许多研究表明,蛋白浓度越高，扩散速率越快。当浓度较高时，蛋白由强静电斥力主导分子间相互作用，膜蛋白形成更致密的构象[16]。PIF的电荷特性决定液滴间静电作用力的强弱，静电斥力强度随着表面电荷数量的减少而下降，相反，具有足够高电荷的PIF可以产生强烈的静电斥力，从而有效防止乳液中悬浮液滴的接近[17]。为方便研究电荷特性对PIF的影响，通常以“剪切平面”处的电势(zeta potential，ζ)进行表征，代表强烈吸附反离子的液滴在电场中能移动的最远距离[18]。

外界环境，如pH、离子强度、温度和冷冻条件等，也会对PIF的结构和性能产生显著影响。氨基和羧基的存在使两亲性蛋白质在较低pH下带正电，在较高pH下带负电，在远离等电点pH条件下静电斥力和离子水化利于蛋白结构展开及巯基的活化，易于形成PIF。当pH接近蛋白等电点时，蛋白分子的展开受到抑制，蛋白溶解度降低，不利于PIF形成，并且由于蛋白之间的疏水作用达到最大，静电斥力逐渐消失，此时蛋白质包覆的油滴倾向于相互靠近发生絮凝，乳液容易失稳[19]。许多蛋白类食品乳化产品中含有盐离子，PIF周围环境中离子强度影响静电斥力的大小和范围。加入盐离子可导致乳清分离蛋白PIF所带负电荷减少，静电斥力减小[19]。当乳液中含有较高水平盐离子或者含有多层反离子时，还会产生静电屏障效应，使水油界面上带电膜蛋白的静电斥力受到屏蔽[20]。食品产品的加工、储藏过程中存在温度波动，热变性温度可诱导蛋白分子发生构象变化，使最初位于蛋白内部的非极性基团和巯基暴露，PIF的表面疏水性增加[13]。冷冻是最常见的贮藏方式，但冷链技术不健全易引起贮存期间冻融循环的发生，引起乳液物理化学特性变化。反复冷冻-解冻阻碍PIF的形成，首先蛋白与油脂交联的能力降低，减少了吸附到水油界面的有效蛋白含量。其次，已吸附的蛋白变性程度增大，使蛋白表面疏水性增强，促进蛋白相互作用形成大分子蛋白，蛋白溶解度降低，乳化液微粒直径增大，最终无法形成稳定的PIF且乳化能力下降[21]。

综上，在内源因素和外界环境的共同影响下，若被PIF包覆的油滴的净吸引力(主要是范德化力和疏水效应)大于净排斥力(主要是静电排斥和空间排阻)，则PIF稳定能力下降、液滴聚集，不同油滴表面PIF上的蛋白分子就有可能发生巯基交换反应，形成共价二硫键，将液滴结合在一起，乳液发生失稳现象[22]。

2 PIF评价方法研究进展

2.1 微观成像技术

人的肉眼仅可以分辨大于100 μm的物体，然而食品中许多常用乳化剂微粒的尺寸远低于该值。各种显微成像技术可观察这些精细结构，直观地提供复杂系统的相关信息。最广泛的用于PIF观察的有光学显微镜(如激光扫描共聚焦显微镜)、电子显微镜(如扫描电子显微镜、透射电子显微镜)和原子力显微镜等。激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)通过激光扫描合成界面结构的三维立体图像，用来确定乳液中液滴的空间位置,并获得关于絮凝体的详细信息[23]。电子显微镜的分辨率高于光学显微镜，透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)与光学显微镜原理相似，但是以电子束作光源，用电磁场作透镜，由于电子束穿透力有限，对样品的厚度有一定要求。扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)用细聚焦电子束在样品表面扫描时激发出来的各种物理信号来调制成像，只能获得关于界面表面结构的二维图像。原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)则具有更高的分辨率，可观察到更微小的界面结构，呈现聚集体的形态和大小信息，但是原子力显微镜成像技术要求使用脱水样品，因此有时需要结合动态光散射测量[24]。

李伟伟[25]用CLSM观察到大豆蛋白形成的乳液粒径较大，出现桥联絮凝现象，从而推测出大豆蛋白吸附速度过慢，蛋白浓度不足以有效覆盖液滴界面，天然大豆蛋白乳化性能不足。采用TEM观察大豆肽在乳液中形成的网状结构，发现由于其肽链分布稀疏，不易在界面上形成高强度的多层吸附膜结构[25]。黄颖等[26]用TEM观察经加热处理的β-乳球蛋白，发现蛋白质的粒径逐渐减小，分布密集程度增加，最后呈现纤维化且直径变粗，表明β-乳球蛋白发生水解，部分以β折叠结构为主的片段在静电排斥和疏水作用共同平衡下有序聚集，蛋白分子间相互作用增强，形成的PIF界面强度较高。通过CLSM和SEM观察比较高压处理对碱提取鳕鱼蛋白的影响，发现当压力由20 MPa上升至100 MPa时，被鳕鱼蛋白包裹的油滴直径显著降低且分布更加均匀。SEM在30.0 k放大倍数下还可清晰地观察到吸附在油滴表面的蛋白微粒[27]。利用AFM对界面吸附平衡后的蛋白膜进行表征，发现β-乳球蛋白界面膜网络结构存在一定的交叠或聚集，结合其他表面性质参数推断其表面游离巯基含量较高，易形成二硫键导致PIF形成过程中界面分子间发生交联[28]。

2.2 热力学方法

蛋白吸附初始阶段，静电力和疏水相互作用下乳液体系释放大量热能，驱动蛋白质继续吸附到界面上，达到平衡状态后，电荷中和引起的构象变化导致体系从放热转变为吸热。因此与蛋白质结构稳定性相关的热力学研究有助于揭示PIF的形成规律。其中，蛋白自然构象(折叠态)和变性构象(展开态)之间的能量跃迁，是表征蛋白空间结构变化的直接指标，也是研究PIF形成过程中蛋白三级结构和四级结构变化的关键。差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)是一种广泛采用的热分析技术，DSC图谱的峰值温度Tm代表蛋白变性温度，反映蛋白结构的稳定性;焓变H代表引起构象变化所需的能量，是吸热效应(如氢键的破坏)和放热效应(如疏水相互作用的破坏)的叠加，DSC是直接测量H的唯一方法[29]。采用DSC技术测定蛋白热变性情况，结果表明吸附至水油界面后蛋白变性峰减小或消失[30]。近年来,许多研究期望通过调控PIF形成来提升乳液稳定性，DSC为达到上述目的提供了检测手段。根据蔡汝莹[31]的实验结果，加入血浆蛋白、鸡蛋分离蛋白、酪蛋白酸钠可以改变肌原纤维蛋白的Tm，使蛋白内部疏水基团暴露，形成分子间疏水相互作用，促进二硫键形成，增强蛋白分子结构稳定性，从而提高PIF强度。脉冲超声也可以增强PIF稳定性，DSC结果表明,肌球蛋白的Tm随处理时间增加而降低，由于分子间疏水相互作用增加,蛋白分子内作用力被破坏，蛋白分子结构稳定性降低，与此同时,H数值在脉冲超声处理的前6 min下降,而后在9～15 min出现回升，证明蛋白质发生解折叠，分子内疏水键受破坏，分子间疏水键形成，促进PIF形成[32]。

2.3 光谱技术

2.3.1 色氨酸荧光光谱

荧光光谱广泛应用于表征蛋白结构和蛋白相互作用，光激发固有的荧光基团至高能状态，然后测量样品吸收光的发射情况。蛋白中主要的荧光基团是色氨酸的吲哚基团，其发射荧光强度对溶剂极性高度敏感，因此色氨酸光谱的变化可用来识别蛋白在水油界面上吸附时的构象变化。当色氨酸残基从疏水环境移动到亲水环境时，最大发射波长发生红移；相反色氨酸残基由亲水环境移向疏水环境时发生蓝移[33]。在295 nm左右的激发波长下，埋藏在蛋白疏水核或结合在疏水溶剂中的色氨酸残基以最大波长约335 nm发射。而蛋白变性后暴露在亲水溶剂中的色氨酸发射波长红移至355 nm左右。在普通荧光光谱中，光以90°的入射角激发样品，但在乳液中由于大量的光被吸收或散射，发射的荧光不足以到达探测器，导致信号较差。为了避免这一问题，水油乳液中的研究通常采用表面色氨酸荧光光谱。入射角调整为30°～60°(不设置45°)，光穿透前10 μm，一部分反射到90°的探测器上，从而获得良好的信号。GUO等[34]研究发现,牛血清蛋白在鱼油/水界面上的构象变化受疏水效应驱动，乳液中的荧光发射光谱出现蓝移现象，这是因为色氨酸残基与电子吸收配体间形成氢键，蛋白中疏水区域也被重新定向到油相的疏水区域。该研究表明PIF的形成与油相的极性相关，最大发射波长的移动程度可随油相极性的增加而缩小。而在含10%大豆油的乳液中，大豆分离蛋白吸附到水油界面后,荧光发射最大位置发生红移而非蓝移，排除了色氨酸位于疏水区域并插入油相的可能性。此外，由于混合蛋白质在形成PIF时发生蛋白间相互作用，因此光谱上大豆分离蛋白红移的程度小于组成它的2种蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)各自红移的距离[33]。

2.3.2 傅里叶变换红外光谱

水油界面蛋白质的二级结构也可以通过傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)进行测定。光谱中的峰是化学键振动吸收能量的结果，酰胺I区(1 580～1 720 cm-1)和酰胺II区(1 510～1 580 cm-1)对蛋白质结构的表征尤为重要，而氢键和过渡偶极子间的耦合是调控蛋白质酰胺带构象敏感性的两大关键因素[35]。典型二级结构的峰值分布如下：β折叠(1 610～1 631 cm-1)，无规则卷曲(1 638～1 648 cm-1)，α螺旋(1 649～1 660 cm-1)，β转角(1 660～1 680 cm-1)以及β反向折叠(1 680～1 692 cm-1)。通过高斯函数可计算得到相应的峰值面积[36]，用于表征不同二级结构的比例。FTIR适用于研究各种环境下的蛋白质，其优点在于既可观察连续相的蛋白质，也可观察特定位点的蛋白质，并且该技术对蛋白质体系没有扰动。此外，乳液产生的光散射不会干扰其信号，因此FTIR被广泛应用于测量吸附在水油界面上蛋白质的构象。

FANG等[37]较早使用FTIR研究了β-乳球蛋白吸附到大豆油水油界面的构象变化。结果表明，吸附导致分子内β折叠减少，α螺旋不变，无规则卷曲增加以及分子间β折叠减少。同时，研究指出环境pH对乳液有显著影响， pH 6.0 时乳液中蛋白较pH 7.0时更易发生变性。LEFEVRE等[38]得出相似结论，pH=6 时β-乳球蛋白无规则卷曲和分子间β折叠更多，而pH=7时α螺旋含量更高。然而在SAKUNO等[39]的研究中，乳球蛋白在二酰基甘油/水和三酰基甘油/水界面的分子间β折叠增加，甚至只能检测到细微的结构变化。这些研究的差异在于FTIR在提取蛋白质信号时需要从乳液光谱信号中分别减去水相和油相的光谱信号。由于纯油相的信号与乳液中油相信号存在差异，而油相浓度又较高，导致最后所得的蛋白质信号存在误差。SCHESTKOWA等[40]改进了FTIR的计算方法，结合荧光光谱和悬滴分析法确定了β-乳球蛋白在中链三酰基甘油/水乳液的临界界面质量分数为0.2%～0.31%。

2.3.3 拉曼光谱

拉曼光谱是FTIR的互补技术，当分子的偶极矩随着分子的振动而变化时，适用FTIR进行检测；而当分子的极化率随着分子的振动而变化时，适用拉曼光谱进行检测[41]。拉曼光谱最有价值的信息是酰胺I带(1 650～1 680 cm-1)和III带(1 240～1 300 cm-1)，前者常被用于鉴定PIF形成前后蛋白二级结构的构象变化，后者涉及的信息包括C-N拉伸带和肽键平面弯曲振动中的N-H，这些波段的频率主要取决于PIF形成过程中蛋白状态、环境及分子间相互作用[42]。水油界面大豆分离蛋白的拉曼光谱显示，随着体系由酸性到碱性变化，酰胺I带的信号峰值逐渐增强，表明pH变化引起膜蛋白二级结构的构象变化[43]。同时，拉曼光谱可以提供膜蛋白侧链氨基酸的微环境，包括链间二硫带、色氨酸带、酪氨酸带和脂肪族疏水残基等相关三级结构的信息。形成PIF的蛋白质通常失去三级结构而保留多种二级结构，二硫键作为维持蛋白质三级结构的重要二级键，其含量是表征蛋白质构象变化的关键信息。500～550 cm-1的伸缩振动来源于2个半胱氨酸形成的二硫键，在510、525和545 cm-1左右的峰值分别表征3种不同构象中的二硫键：邻式-邻式-邻式(g-g-g)、邻式-邻式-反式(g-g-t)和反式-邻式-反式(t-g-t)。此外，脂肪族氨基酸残基在2 800～3 000 cm-1的C-H伸缩振动和1 440～1 465 cm-1的C-H弯曲振动也可用于监测PIF形成过程中的疏水相互作用及构象的转变[13]。比如，光谱在2 930和2 880 cm-1的信号强度比(I2 930/I2 880)可以反映蛋白吸附到油水界面后分子内的C-H链偏转/反式构象变化，2 853和2 880 cm-1的相对信号强度比(I2 853/I2 880)则可以反映分子间C-H链相互作用[44]。研究表明，添加多糖会影响PIF的稳定性，恰当的蛋白/多糖比例能促进更多的蛋白质疏水侧链插入油相中，有利于提高PIF包裹油滴的稳定性[45]。

2.4 界面流变学

乳化过程不受热力学主导，且由于乳化区域的面积较大，乳液稳定性更多表现出动力学不稳定性，发生乳化、絮凝和聚结等失稳现象。因此，从食品工业角度来看，首要目标是提高乳液的动力学稳定性。评价PIF的界面流变性对表征乳液稳定性具有关键意义，它研究的是乳化过程中液滴界面形变及外加应力随时间变化的关系，通常通过向液滴施加膨胀应力或者剪切应力进行测量。在低频率外力扰动时，黏性流动液体的弹性模量可忽略不计，但固体中流动行为受到阻碍，弹性模量充分表征其力学行为。添加乳化剂后，水油界面同时表现出黏性和弹性特性。通过测量界面张力和弹性模量可以预测蛋白质在水油界面的吸附过程，在蛋白质扩散阶段界面张力和黏弹性模量保持不变；当界面单层膜形成并发生蛋白结构重排时，界面张力急剧下降，弹性模量急剧增加；若界面“凝胶化”并形成多层吸附的界面膜，界面张力缓慢下降(尤其是球状PIF)，黏弹性模量缓慢增加。

膨胀流变适用于测定乳液短期稳定性，施加外力时流体的界面面积改变，而界面形状保持不变[46]。利用Langmuir槽法、液滴扩张技术、界面张力弛豫等方法可研究不溶性单分子层和界面蛋白膜，针对蛋白在界面的吸附建立非牛顿流体行为模型[47]。蛋白界面膜的形成、结构展开和重排都可通过膨胀流变学监测。此外，剪切流变提供了更丰富的中长期稳定性信息，在剪切变形中流体的界面形状改变，而界面面积保持不变[47]。利用流变仪搭配磁棒、双锥、Du Noüy环等可对蛋白的界面剪切流变性质进行检测，并提供水油界面上分子间和分子内蛋白质相互作用的信息[48]。ZHU等[49]对比了乳清分离蛋白和牛血清蛋白的界面流变特性，发现前者的PIF表现出较大的膨胀黏弹性模量，这是因为乳清蛋白具有致密的球状结构，通过交联在水油界面形成更稳定PIF，而牛血清蛋白由于吸附量低无法形成致密的PIF。ULAGANATHAN等[50]通过滴形分析技术研究了十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate, SDS)与β-乳球蛋白的竞争性吸附作用，SDS随着浓度的增加逐渐取代β-乳球蛋白占据界面主导地位。较低的SDS浓度对界面张力影响不大，但对剪切弹性和黏度有影响，因为剪切流变检测分子间互作比检测界面张力表现出更高的灵敏度。动态流变测定还可用于研究不同蛋白的界面性质和竞争性吸附。对于吸附可逆的蛋白质，随着界面上吸附蛋白先后经历解吸附、随油滴膨胀重新吸附的过程，界面动态弹性模量随吸附时间的增加呈现先增加后略有下降的趋势[51]。当用肌原纤维蛋白置换鸡蛋分离蛋白和血浆蛋白时，界面张力皆显著下降且低于肌原纤维蛋白界面张力，出现这一结果的原因是在水油界面上肌原纤维蛋白和其他2种蛋白间发生竞争吸附，鸡蛋分离蛋白和血浆蛋白在油滴表面的PIF相对坚固，肌原纤维蛋白仅能取代少量外层吸附蛋白，在整个置换过程中鸡蛋分离蛋白和血浆蛋白仍占主导地位[31]。PIF形成第一阶段PIF的流变特性研究目前正处于快速发展的阶段，界面流变技术可以提供通过其他检测手段难以获得的关于PIF的有效数据和信息。

3 结语与展望

PIF性质对水油乳液的稳定性有显著影响，尽管研究者们对界面蛋白构象变化及界面流变的研究已取得了一定成果，但其与乳液之间的直接关系尚未明确，仍需更多详细、深入的研究。研究者已通过观察外观形貌(微观成像技术)、寻找结构变化的间接证据(热力学方法)、直接测量构象变化(光谱技术)、综合研究动态吸附过程和界面稳定性(界面流变学)，从不同角度测定并分析PIF。微观成像技术最直观地给出了有关界面膜微观构造和尺寸的信息，其中AFM的应用为研究蛋白质聚集体和配体提供了极大便利。热力学方法为吸附过程中蛋白质的构象变化提供了有效的间接证据，DSC已广泛应用于蛋白质高级结构的研究。现代光谱技术的出现使蛋白质二、三级结构信息的获取成为可能，FTIR用于观察水油界面上的蛋白质吸附行为，提供蛋白的二级和三级结构信息，拉曼光谱补充了界面膜蛋白质的二级结构和侧链的相关信息，荧光测量则能有效反映蛋白质吸附到水油界面过程中的氨基酸环境变化。尽管现代光谱技术迅速发展，且因其方便快捷的特点而越来越受研究者欢迎，但是尚存在一定局限。例如，荧光光谱无法检测二级结构且制样耗时。水相中蛋白质的FTIR光谱容易受到极性水溶剂的干扰。拉曼光谱固有的拉曼散射可能影响光谱的分辨率，长时激光辐射产生的热量也可能改变蛋白质构象从而影响测量精度。界面流变学的发展使蛋白质界面性质研究向前迈进一大步，该技术通过结合介观和微观尺度上的参数信息，解决了流体-流体界面蛋白质构象变化及其表面流变行为的相关问题。但对于复杂PIF的动力学问题，仅凭界面流变技术无法彻底解决，需要进一步建立能正确描述复杂界面动力学的模型。因此，综合使用这些技术将形成优势互补，为PIF的定量结构分析提供更准确有效的信息。

虽然环境因素对PIF结构影响的研究较多，但相关的乳液稳定性调控方法及响应机制仍有待建立。现有研究中，通过调控PIF的形成过程提升乳液稳定性，通过改变蛋白构象，增强蛋白柔韧性，提高蛋白乳化活性，引起水油界面中吸附蛋白高级结构变化，从而提高蛋白乳化特性。常见的调控方法有超高压处理技术、超声处理技术、酸碱处理技术、糖基化修饰技术等。未来PIF的相关研究工作可从以下展开：第一，提高目标乳液体系的多样性，包括系统性探究不同水油比例和不同蛋白来源的乳液PIF。当前大多数有关PIF的研究都是基于水包油的乳液体系，体系中油相比例较低而水相比例较高，探究高油相比例的PIF形成情况有利于更好理解PIF对油包水乳液稳定性的作用机制和规律。此外，现有的PIF研究对象集中于水溶性蛋白，如β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白、寡聚蛋白等，而以肉源性蛋白为代表的盐溶性蛋白形成的PIF研究则较少，相关的PIF形成机制需要进一步明确。第二，建立适用于复杂流体的PIF分析模型。上文已证明界面流变特性对PIF表征的重要性，及其用于建立蛋白乳化液宏观与微观联系的有效性。一些研究者尝试建立数学分析模型，通过关联PIF的黏弹性性质、微结构参数、组成和界面张力来预测蛋白对乳液的稳定作用，广泛应用的有Young-Laplace方程、Ward-Tordai方程、一阶唯象方程、梅森模型等，未来仍需建立更精确的模型用于描述复杂PIF的吸附行为和特性。第三，发展基于计算机科学和信息技术的动态界面监测技术。目前对PIF界面流变性能的监测实验中界面相对静止，蛋白质可以有序吸附，而实际情况下蛋白质吸附到水油界面形成PIF是一个动态的乳化过程，相邻液滴间有拉普拉斯作用力且可能存在共享相同PIF等情况。因此PIF的未来发展依赖于电子信息技术的发展、智能分析软件的开发以及全面的动态界面监测设备的设计。