超声波技术在微生物工程中的应用进展

李云亮，王晓静，阮思煜，周安奇，刘晓霜，徐雅宣，马海乐

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

微生物工程起源于20世纪70年代，是指利用微生物的生命活动，通过现代化工程技术，生产人们所需的物质或直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代化基因工程、细胞工程等新技术结合并迅速发展起来的现代发酵技术[1-3]，主要侧重于微生物资源的开发利用、微生物菌种的选育培育、生物反应器的设计、发酵条件的优化、发酵过程参数快速检测以及产物的提取和分离等方面[4-5]。

超声波是频率高于20 kHz的声波，与可闻波（频率在16～20000 Hz）相比，频率更高、波长更短，在传播过程中具有方向性好、能量大、穿透能力强和易引起空化作用等特有性质[6]。近年来，随着国内外超声波生物反应设备的研究和开发，超声波对微生物工程的影响正引学者广泛的关注。超声波在实际应用中主要分为功率超声波和检测超声波[7]，前者一般利用超声波作为能量载体；后者一般利用超声波作为信息载体。超声波作为能量载体，在微生物工程中主要集中应用于遗传育种、强化发酵工艺、有害微生物控制、发酵产物的提取与分离等方面[5]；作为信息载体，主要用于检测发酵产物的浓度[8]。结合本课题组近年来的研究成果，本文对超声波技术在微生物工程中的应用进展进行了详细论述。

1 功率超声波的应用

1.1 基因工程与遗传育种

功率超声波在基因工程与遗传育种中主要应用于两方面：一是超声波诱导基因转移，即在超声的空化作用下，空泡周围细胞的细胞壁和质膜被击穿或质膜透性可逆改变，细胞内外物质相互交换，从而将外源基因导入细胞中[7]；二是超声波诱导基因突变，其作用机制可能是其产生的高温、高压和自由基，致使遗传物质发生突变[9]。

基因转移是指人为的将目的基因转移入受体细胞内的过程，可以使菌体快速获得新的遗传性状进而表达，在基因工程中发挥着重要作用[10]。与其他基因转移方法相比，超声波诱导基因转移法具有安全可靠、操作简单、可控制性强等优点。早在1990年，许宁等[11]首次通过超声波处理将外源基因导入植物组织和带壁细胞中，使外源GUS基因在小麦愈伤组织中获得了短暂表达。宋厚辉等[12]建立了一种简单快速的、采用低频、低功率超声波介导的遗传转化体系，利用超声波在微生物细胞膜表面形成的瞬时微型囊泡裹入细胞外部的生物大分子，在细胞自我修复的同时，囊泡连同内容物一起嵌入细胞内部，完成转化过程。何正文[13]简化了超声波转化法，将质粒pET-20b（+）成功转入宿主细胞大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中。孙尚琛[14]研究分析了超声波介导转化过程中的宿主细胞的理化性质和转化发生的基础条件，结果表明与宿主细胞内外膜通透性的改变、二价金属离子与细胞壁成分肽聚糖的相互作用等有关。王永刚等[15]利用超声波成功将质粒pET28α转化到枯草芽孢杆菌中，发现不同条件超声波处理均能改变细胞膜通透性，且胞内物质的释放量与超声波处理的时间和频率具有相关性，通过电镜观察到超声波处理后的细胞外表面凹凸不平、褶皱变形，推断超声波介导的DNA转化是细胞生理响应和超声波共同作用的结果，揭示了超声波诱导基因转移的生物学机制。

超声波诱导基因突变作为一种新型物理诱变技术，具有操作方便、安全、效果好等优点，应用于微生物育种，既能单独使用又能联合其他方法诱变。刘艳等[16]用超声波诱变筛选虾青素高产菌株，出发菌株CTD004经过三轮超声波诱变后，菌株产虾青素能力达到190.6 mg/L，比出发菌株增加了126.0 mg/L。刘娴等[17]以啤酒酵母为出发菌株，经紫外和超声波复合诱变后，菌株果胶提取率提高了6.38%，并且突变株具有良好的遗传稳定性。王庆权等[18]通过超声波诱变结合苯磺隆抗性处理，获得了双乙酰生成量明显降低的啤酒酵母突变株，在连续传代20次后，突变菌株特性均无明显变化。王亮等[19]通过将超声波和硫酸二乙酯复合诱变，得到黄嘌呤和鸟嘌呤双重营养缺陷型突变株xan－gua－-c，在发酵20 d时其虫草素产量比原始菌株提高了40%左右，解决了虫草素低产率从而限制了其大规模生产和应用的问题。

工程菌所表达的异源蛋白分为可溶性部分和不溶性的包涵体部分，包涵体的形成对蛋白质结构正确折叠是不利的，但是对于一些对蛋白质空间结构要求不严格的重组蛋白的表达非常有利，如复性容易的重组蛋白和一些后续需要化学试剂或蛋白酶处理的蛋白。以包涵体形式表达的重组蛋白在微生物工程下游生产过程中具有一定优越性，因此李云亮等[20]发明了一种促进重组蛋白包涵体形成的方法，在对工程菌诱导表达时，在不提高诱导物（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）浓度的前提下，采用扫频式超声波设备对工程菌进行低强度、短时间的超声波处理，加快了诱导物的渗透，使重组蛋白高表达时更易形成包涵体。该方法操作工艺简单，降低了诱导物对宿主细胞的毒害作用，并且适用于在较低的诱导温度下才能表达重组蛋白的工程菌。

1.2 发酵过程

微生物发酵过程中应用超声波技术，可使细胞表面瞬间造成微伤，破裂细胞壁，改变细胞膜通透性，细胞内含物被释放。在超声波功率较低时，对微生物的伤害较小，很容易自身修复，对生物体不会造成损伤或死亡[21]。低功率超声波应用于微生物的发酵过程中，不仅可以加速细胞生长，而且可以促进有益次生代谢产物的合成[22]。

国外关于超声波技术应用于发酵过程中的研究开展的较早也较多，国内虽然起步较晚，但也取得了一定成果。Dai等[23]研究了低频率超声波刺激对核黄素发酵生产阿氏假囊酵母（E.ashbyii）的影响，结果表明，不同频率的低频率超声波处理均能促进菌丝生长，处理后的发酵液中的葡萄糖和核酸含量均下降，在最优条件下，发酵时间缩短36 h，次生代谢产物核黄素产率提高约5倍。孟祥勇等[24]进行了循环超声波辅助黄酒后发酵风味物质的变化分析，发现此处理不仅可维持黄酒的酒精度，还能提高黄酒醪液氨基酸和酯类的总含量，显著降低高级醇含量，缩短发酵时间和酿造周期。Dai等[25]在研究低强度超声波对酿酒酵母生长、细胞膜通透性和乙醇耐受性的影响中发现，在频率为28 kHz、功率为140 W/L、持续时间1 h的条件下，超声波处理使酿酒酵母生物量增加了127.03%，超声波处理还可增强酿酒酵母菌细胞膜的通透性，细胞外蛋白、核酸和果糖-1,6-二磷酸的含量增加，酵母菌可以耐受培养基中浓度较低的酒精。孙悦[26]研究探讨了超声波对巴氏醋杆菌发酵生产的影响，结果表明，在超声波条件为功率600 W、时间15 min、温度40 ℃时，巴氏醋杆菌的生物量增加了82.35%；在巴氏醋杆菌生长稳定中期（25 h）时进行超声波处理，其总酸含量比对照组高16.70%。Huang等[27]研究了利用超声波处理副干酪乳杆菌生产酸奶肽的三种方案，在最优此条件下，发酵培养基中肽的含量为5.9 mg/mL，比对照组样品增加了64.23%，肽产率为14.2%。同时研究发现超声波处理提高了发酵培养基中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活性。以上研究为实现超声波技术在传统食品发酵工业化生产中的应用提供了可行性。

关于超声波和微生物之间相互作用的机制，有学者提出，超声波的空化作用促进了菌体可逆渗透，提高了细胞内外物质的运输能力，减少了次级代谢产物的积累对微生物的抑制作用，从而提高了代谢产物的得率，也有学者认为，CO2会抑制细胞生长，而低强度超声波可以减少发酵液中CO2的溶解度，从而促进细胞增殖[21]。Huang等[28]利用自行研制的扫频超声波设备对热带念珠菌进行低强度超声波辐照，结果表明，超声波处理后细胞通透性和细胞生长速度明显提高，控制热带念珠菌增殖的关键基因显著上调，从遗传学水平初步解释了超声波促进微生物增殖的机制。刑欢[29]研究发现，低强度超声波可以促进热带假丝酵母增殖，在最佳处理条件下，菌体生物量增加值最高可达到148.5%，并通过转录组测序技术发现了超声波促进热带假丝酵母增殖的关键基因和信号通路，阐释了低强度超声波调控热带假丝酵母细胞周期的分子机制。

目前为止，大多数关于超声波处理促进微生物发酵的研究都是采用间歇超声波处理方法进行的，Zhang等[30]开发了一种新型超声波设备，即多频扫描槽式超声波设备，采用原位超声波辐照促进发酵的方法，探讨了不同工作模式（固定频率和扫频）、不同频率的超声波处理对酿酒酵母生长和代谢产量的影响。结果表明：固定频率超声波能显著促进酿酒酵母的生长和代谢产量，并发现在最佳工艺条件下（频率23 kHz、发酵时间48 h），乙醇的产量增加了19.33%，β-苯乙醇等代谢物的含量也增加，证实了原位超声波处理方法比间歇处理方法更适用于工业发酵生产。

1.3 有害微生物的控制

超声波空化作用可以使液体产生瞬间高温、高压变化，使微生物细胞内容物受到强烈的震荡，从而达到对微生物的破坏作用，即达到杀菌的目的[31]。将超声波技术应用于控制微生物的生长或消灭有害微生物，具有能耗低、时间短，有效保留产品的营养成分和色香味等特点[32]。

朱邵华[33]利用超声波发生仪对酱油进行灭菌处理，证明超声波可以对液体食品进行有效灭菌，当超声波灭菌4 min以上时，酱油样品中微生物菌落总数明显下降，死亡率达到68.4%。吴雅红等[34]用超声波技术代替高温灭菌，发现经超声波灭菌后的绿茶茶汤，虽有少量金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌生长，但在安全卫生标准范围内，并且茶多酚损失率小于高温灭菌的茶多酚损失率。楚文靖等[35]研究了超声波处理对蓝莓汁杀菌率和品质的影响，结果显示超声波参数对蓝莓汁杀菌效果有显著影响，最佳杀菌条件为功率180 W、超声时间8 min、超声温度40 ℃，此时蓝莓汁的杀菌率可以达到64%，且超声波处理对蓝莓汁可溶性固形物、pH及色泽影响较小。

与传统杀菌方法相比，超声波杀菌效果有限，因此近年来研究者常将超声波作为辅助杀菌方法，与其他杀菌技术联合使用，以提升杀菌效果[32]，目前已有研究将超声波与温度[36]、臭氧[37]、纳米二氧化肽[38]、微波[39-40]、激光[41]、脉冲光[42]、抗菌剂[43]等协同灭菌。张曜[36]采用超声波细胞粉碎仪作为副溶血性弧菌的杀菌设备，发现当超声波频率为500～600 Hz时与温度的协同效果最佳，杀菌率可达97%左右。Brenda等[44]研究发现微波与超声波技术结合处理可用于黑莓汁中微生物的灭活，处理后的黑莓汁与对照组相比，霉菌、酵母菌和好氧菌数量明显下降，并且在贮藏一个月后，果汁中总多酚和花青素的保留率分别为87%、90%。Wang等[45]探索了一种紫外辅助超声波杀菌技术，这种技术用于芒果汁的杀菌，不仅对果汁感官特性的损害最小，而且提高了芒果汁的营养价值和安全性，具有极高的商业价值。

目前的研究大部分是对超声波工艺参数的优化，对于超声波杀菌的机制研究较少。王薇薇等[9]提出超声波杀菌的主要机制是空化效应使细胞壁变薄及其产生的局部高温、高压和自由基。Fan等[46]研究了超声波和热处理协同钝化枯草芽孢杆菌孢子及其机制，结果发现超声波频率20 kHz、功率密度20 W/mL、温度80 ℃处理40 min时，芽孢菌落数的对数值减少了2.43±0.08，同时发现大量细胞死亡和DPA（吡啶-2,6二羧酸）释放，表明超声波和热协同杀灭枯草芽孢杆菌孢子不是通过灭活孢子皮层溶解酶或萌发受体，而是通过损害某些中间代谢关键酶使孢子失活，但对这些关键酶还需进一步鉴定。迟媛等[47]在研究超声波协同次氯酸钠对腐败菌的杀菌效果中发现，两者协同作用会极大损伤菌体细胞外层结构，胞内物质外溢、细胞器溶解及细胞皱缩等情况更为严重，与相同时间下单独次氯酸钠杀菌效果相比，协同作用杀菌对数值提高了13%～67%，并提出该效应的作用机制可能是因为在杀菌过程中，超声波优先作用于菌体细胞壁，超声波的空化效应破坏了菌体外层结构，因此次氯酸钠直接作用于裸露的菌体，两者的协同作用强化了杀菌效应，从而加速菌体细胞死亡。

1.4 发酵产物的提取分离

超声波提取技术是在传统提取方法的基础上发展起来的一种新技术，根据超声波的空化等性质破坏细胞，降低物质溶出阻力，提高扩散速率，从而获得所需物质，与传统提取方法相比，具有操作简单、不需要加热、提取速度快，产品得率高等特点[48]。

超声波提取技术多用于提取中草药等天然药物[49-50]，近年来也被广泛应用于微生物发酵产物的提取。张红[51]从汾河淤泥中分离得到高产类胡萝卜素的菌株PSB-B，比较酸热裂解法、研磨法、超声波法三种方法提取类胡萝卜素的效果，得出超声波提取法效果最佳，为工业化低成本高产量生产类胡萝卜素提供了理论依据和指导。盛悦[52]采用超声波辅助提取法对猴头菌液体、固体发酵产物中的多糖提取工艺进行了优化，在最优条件下，液体发酵产物多糖得率为7.03%，比传统热水浸提法提高了61.61%；固体发酵产物多糖得率为5.84%，比传统热水浸提法得率提高了50.52%。Salim等[53]以豆粕为底物，采用固态发酵技术培养枯草芽孢杆菌产蛋白酶和α-淀粉酶，研究中发现，超声波辅助提取法比优化后的传统提取工艺获得的酶产量更高，蛋白酶产量最高可达到330 IU，α-淀粉酶产量最高可达到825 IU，并且提取时间明显缩短。

常用的分离方法有离心和过滤，但离心机存在不易与在线系统兼容、过滤器易堵塞等问题，Hawkes等[54]设计了一种分离系统，该系统以酿酒酵母为模型细胞，利用超声驻波的力量作用于细胞，从而将细胞从悬浮液中分离出来。此系统可用于连续过滤分离，而且方便调节流速，易于在线使用且不受物理堵塞限制。Coakley[55]使用此方法，在低功率超声波条件下分离酵母和大肠杆菌，结果表明，与离心分离法相比，酵母和大肠杆菌的分离速度快了3倍。此外，在分离细胞和分子方面，超声波分离技术与常规的磁珠和介电泳相比也有很多优势。

2 检测超声波的应用

超声波具有较强的穿透能力，当其信号较微弱时，其产生的能量不足以改变发酵液中细胞、酶等的生物性能，但发酵液产物的浓度、粘度等这些物理参数会影响声波的传播性质，因此可利用这一特点实现超声波的在线检测[56]。Cowan等[57]用柔性板波(FPW)传感器（一种超声波传感器）检测大肠杆菌W3110在重力作用下细胞在溶液中的浓度变化，改进了传统的细胞浓度测定方法，这种技术只需要很少的样本量且允许在线数据收集。王武等[7]以麦汁为底物，在超声波频率为5.8 MHz时，利用超声波技术进行了啤酒发酵过程中酵母浓度测量的实验研究，发现在不同的温度时，酵母浓度的变化对超声波传播速度的影响较大。高月华[58]根据超声波测量原理，设计出一种超声波检测仪，用于发酵过程中酵母浓度的在线检测，其测量系统由测量传感器、超声波信号发生器、检测电路、微机系统等组成，此检测仪可在工作现场高温灭菌，且不污染发酵物。

与其他检测技术相比，超声波技术用于微生物发酵产物浓度的在线检测，具有适应性强、设备成本低、操作简单易上手等优点，其应用前景十分广阔。根据现有研究报道发现[59-61]，利用超声波技术制备生物反应设备和生物传感器虽有一些进展，但这些设备的有效利用取决于超声波对其目标物质的作用机制是否清晰。目前此技术在液态发酵中应用较多，如啤酒中酵母浓度、乙醇浓度[62]、醋酸浓度等检测，而很少应用于固态发酵在线检测[63]，这可能与相关模型的建立难易程度有关。

3 展望

目前超声波技术已广泛应用于微生物工程中，可以促进微生物生长，缩短发酵时间，进行菌种诱变，提取发酵产物、有害微生物控制以及在线检测产物参数等。此类研究大多集中于超声波工艺的优化，在超声波引起的细胞结构、成分及功能改变机制等方面的报道很少，在这些方面的进一步研究有助于更加有效的控制超声波处理过程，应是科研人员今后研究的方向。将超声波技术等物理手段用于微生物工程中，对我国食品科学及微生物发酵技术的发展具有重要意义。