紫杉醇耐药对食管癌细胞增殖、迁移及血管形成的影响

杨成园，邓青，郭紫婵，魏媛，王雪薇，张震，赵蓉，李孝敏，贺杰峰，王晓霞

1.山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西太原030001；2.山西白求恩医院普外科，山西太原030032

食管癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命健康。据2018 年全球癌症统计显示，食管癌发病率居第七位，总死亡率排名第六位［1］。目前，食管癌的治疗手段主要以手术加放化疗为主，化疗在延长患者生存期方面具有重要作用。随着新化疗药物的上市，食管癌化疗疗效得到进一步提高。但仍有部分患者无法获益，其中化疗产生耐药性是导致临床疗效差的主要原因之一［2-3］。因此，研究化疗耐药产生的机制，并进一步寻求耐药逆转的有效方法具有重大的临床意义。

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一种广谱的细胞毒性药物，主要通过促进微管蛋白聚合，使细胞在进行有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，从而抑制细胞分裂及增殖，发挥抗肿瘤作用［4-5］。目前PTX 被广泛应用于各种肿瘤的临床治疗，但化疗耐药性的产生严重阻碍了其临床疗效［6-8］。因此，阐明PTX 耐药的机制对克服耐药具有重要的临床价值。

建立细胞耐药模型是体外研究肿瘤耐药机制的前提［9］。因此，本研究首先通过体外间歇诱导加浓度递增的方法模拟临床化疗耐药产生的过程，建立了耐药细胞株KYSE150 ／ PTX，并研究PTX 耐药后对食管癌KYSE150 细胞恶性表型的影响，进而探讨其耐药的可能机制以及导致化疗失败的原因。

1 材料与方法

1.1 细胞 人食管癌细胞系KYSE150 购自中国医学科学院；人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）购自江阴齐氏科技生物有限公司。

1.2 主要试剂 PTX 注射液购自哈药生物工程有限公司；RPMI1640 培养基及胎牛血清（FBS）购自美国HyClone 公司；胰蛋白酶-EDTA 购自北京索莱宝科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）及DMSO 购自美国Sigma 公司。

1.3 PTX 耐药细胞系的建立及细胞形态观察 当KYSE150 细胞密度达80%～90%时，用含0.005 mg／L PTX 的培养基孵育 48 h；PBS 洗涤 3 遍，更换不含PTX 培养基继续培养，第3、27 天时观察细胞形态并拍照；待细胞恢复生长后，逐步提高PTX 浓度，每次均培养48 h 后更换不含PTX 培养基继续孵育，如此反复，至细胞在 PTX 浓度为 0.05 mg ／ L 的培养基中正常生长，最后获得的细胞即为PTX 耐药细胞系（KYSE150 ／ PTX），倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.4 PTX 耐药对细胞增殖能力影响的检测 采用MTT 法。试验共设空白组、对照组及实验组，每组3个复孔，其中空白组仅加入RPMI1640 培养基，对照组加入KYSE150 细胞，实验组加入KYSE150 ／ PTX细胞。采用MTT 法，按每孔1 000 个细胞接种至96 孔板，培养 1 ～ 8 d；避光加入 40 μL MTT 溶液（5 mg ／ mL），继续培养 4 h；吸净 MTT 残液，加入DMSO，100 μL ／ 孔，溶解 10 min；于酶标仪 490 nm波长处检测A 值，每隔24 h 检测1 次，共检测8 d，绘制细胞生长曲线。

1.5 PTX 耐药对细胞克隆形成能力影响的观察 采用克隆形成试验，分组见1.4 项。将细胞制备成单细胞悬液，均匀接种至60 mm 培养皿中，1 000 个／皿，常规培养约 10 d；弃上清，加入甲醇，1 mL ／ 皿，静置15 min；结晶紫染色 20 min；PBS 洗涤残留液，拍照并计算克隆形成数目。

1.6 PTX 耐药对细胞迁移能力影响的检测 采用划痕愈合试验，分组见1.4 项。将细胞制备成单细胞悬液，接种至 60 mm 培养皿中，5.0 × 105个 ／ 皿，细胞完全融合后用200 μL 枪尖快速划过细胞，PBS洗涤2 次，加入1.5 mL 不含血清的培养基，拍照后放入孵箱继续培养24 h，再次拍照划痕区。用Image J 软件分析划痕愈合情况，即分析划痕宽度的改变并按下式计算细胞迁移率。

细胞迁移率（%）=（T0h的划痕面积- T24h的划痕面积）／T0h的划痕面积 × 100%

1.7 PTX 耐药对细胞体外小管形成能力影响的检测 采用体外小管形成试验，分组见1.4 项。将细胞用无血清无抗生素的RPMI1640 培养48 h 后，收集细胞培养基，离心5 min 取上清。将4 ℃融化的基质胶加入预冷的96 孔板，50 μL／孔，置孵箱30 min。消化HUVEC 细胞制成单细胞悬液，使其终浓度为5×104个 ／ mL，铺至提前预冷的 96 孔板中，20 μL ／ 孔，再加入细胞上清，40 μL ／ 孔，混匀，镜下观察小管生成情况，于6 h 后拍照并计算小管数目。

1.8 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，实验数据以均数 ± 标准差（mean ± SD）表示，组间比较采用t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTX 耐药细胞系KYSE150／PTX 的建立及形态观察 经过10 个月成功建立PTX 耐药细胞系KYSE150 ／ PTX，可在含 0.05 mg ／ L PTX 的培养基中稳定生长。在药物诱导过程中，KYSE150 细胞在加药后约在第3 天开始大量死亡，残存的少数贴壁细胞内黑色颗粒物增多，细胞变大、不规则；但约在第27 天会出现新的细胞克隆，与KYSE150 细胞形态相似，体积略大；在正常传代3 ～4 次后，细胞形态逐渐与原细胞接近。见图1。

图 1 KYSE150 细胞及 KYSE150 ／ PTX 细胞形态的显微镜观察（× 100）Fig.1 Microscopy of morphologies of KYSE150 and KYSE150 ／ PTX cells（× 100）

2.2 PTX 耐药对细胞增殖能力的影响 结果显示，连续培养 8 d，可见 KYSE150 ／ PTX 细胞 A490值均低于其亲代细胞KYSE150，见图2。表明PTX 耐药可抑制KYSE150 细胞增长。

图2 PTX 耐药对KYSE150 细胞增殖能力的影响Fig.2 Effect of PTX resistance on proliferation of KYSE150 cells

2.3 PTX 耐药对细胞克隆形成能力的影响 结果显示，连续培养约10 d，KYSE150 细胞和KYSE150 ／PTX 细胞形成的克隆数目分别为（172.00 ± 48.50）和（33.67 ± 17.95）个，统计分析各组中形成的克隆团（含至少50 个细胞）数目，两者细胞克隆形成能力差异有统计学意义（P = 0.025 6），见图3。表明PTX耐药可使KYSE150 细胞克隆形成能力降低。

图3 PTX 耐药对KYSE150 细胞克隆形成能力的影响Fig.3 Effect of PTX resistance on colony formation of KYSE150 cells

2.4 PTX 耐药对细胞迁移能力的影响 结果显示，划痕0 h 时，划痕宽度接近一致，划痕24 h 后，与KYSE150 细胞相比，KYSE150 ／ PTX 细胞划痕已基本愈合，细胞迁移率分别为（58.79 ± 3.63）%和（87.06± 2.61）%，差异有统计学意义（P=0.000 7），见图4。表明PTX 耐药后KYSE150 细胞的迁移能力增强。

图4 PTX 耐药对KYSE150 细胞划痕愈合能力的影响（× 100）Fig.4 Effect of PTX resistance on wound healing of KYSE150 cells（× 100）

2.5 PTX 耐药对细胞体外小管形成能力的影响 加入细胞上清6 h 后，与KYSE150 细胞相比，KYSE150／PTX 细胞形成的小管更多，且管腔更为完整，二者血管形成数分别为（66.70 ± 9.26）和（120.20 ±36.52）个，差异有统计学意义（P = 0.000 6），见图 5。表明PTX 耐药后血管形成能力增强。

图5 PTX 耐药对KYSE150 细胞体外小管形成能力的影响（× 100）Fig.5 Effect of PTX resistance on tubule formation of KYSE150 cells（× 100）

3 讨 论

PTX 是治疗食管癌的常用化疗药物，但PTX 耐药严重影响了临床疗效［10］。目前，体外建立肿瘤耐药细胞系是最经典的研究肿瘤耐药的方法。本研究采用低浓度药物间歇作用加浓度递增的诱导方式建立PTX 耐药细胞。在诱导过程中，大多数细胞在加入药物初期体积会增大，细胞质中出现许多空泡，细胞逐渐死亡并漂浮，一段时间后极少数存活细胞开始缓慢生长而后恢复指数生长，最终历时约10 个月，成功构建PTX 耐药细胞系，并命名为KYSE150 ／PTX 细胞。

研究发现，与亲代细胞相比，KYSE150 ／ PTX 细胞增殖能力减弱，这与其他肿瘤耐药系研究结果一致［11-12］。从细胞生长曲线和克隆形成试验结果可以看出，KYSE150 ／ PTX 细胞生长速度减慢，克隆形成率下降，可能是肿瘤细胞在长期接受药物刺激后做出的主动应激反应，以逃避细胞免受毒性药物的侵害［13］。划痕愈合试验发现，PTX 耐药可增强食管癌细胞的划痕愈合能力，说明PTX 耐药后，KYSE150 细胞迁移能力增强，提示PTX 耐药增加了肿瘤细胞的恶性表型。另外，在肿瘤的发生发展过程中，血管的生成是一个及其关键的步骤，一方面，新生血管会长入肿瘤中，为肿瘤提供充足营养并运输生长因子刺激其生长；另一方面，肿瘤细胞会侵入新生血管通过血液转移至其他部位，从而引起肿瘤转移［14］。本研究通过体外HUVEC 细胞小管形成试验发现，PTX耐药导致肿瘤血管生成能力增加，表明PTX 耐药为肿瘤的复发及转移提供了可能。

本研究通过体外间歇诱导加浓度递增的方法模拟临床化疗诱导耐药细胞的产生过程，建立了PTX耐药细胞株KYSE150 ／ PTX，并发现PTX 耐药后食管癌细胞增殖、迁移及血管生成能力发生改变，提示这些生物学表型的改变可能是PTX 耐药影响临床治疗效果的重要因素。同时，本研究建立的稳定PTX耐药细胞模型为今后进一步揭示食管癌细胞耐药的机制奠定了实验基础。