共济失调毛细血管扩张突变基因缺陷对小鼠心肌梗死后心脏重塑的影响

卢煜，刘卓慧，程肖霞，解军

山西医科大学出生缺陷与细胞再生重点实验室生物化学与分子生物学系，山西太原030001

心肌梗死是一种严重的心血管疾病，在大多数情况下，是由易受损动脉粥样硬化斑块破裂或冠状动脉内皮糜烂引起的。近年来随着医疗水平的不断发展，经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）及其他治疗方法均可显著提高急性心肌梗死患者的生存率。然而，这会导致心肌梗死患者术后发生心力衰竭的风险［1］。心肌梗死后心力衰竭的发展与心脏几何结构和功能的改变密切相关，包括炎症反应和瘢痕形成，也被称为心脏重塑。心肌梗死后心脏重塑的过度和延长可导致心室功能受损和心力衰竭［2］。因此，更好地了解心肌梗死后的细胞和分子机制对调节心脏重塑具有重要意义。

共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）编码一种丝氨酸 ／ 苏氨酸蛋白激酶，可被氧化应激［3］、DNA 双链断裂［4］，或者转化生长因子β［5］等激活，这些刺激与心肌梗死以及心肌梗死后心脏重构有关［6-7］。但ATM 是否参与心肌梗死后心脏重塑的作用和机制尚不完全清楚。本研究通过结扎冠状动脉左前降支的方法构建小鼠心肌梗死模型，利用ATM 单倍体基因缺陷小鼠以及同窝野生型小鼠探究ATM 对小鼠心肌梗死后心脏重塑的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 马松三色染色液购自北京雷根生物技术有限公司；羊血清工作液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；苏木素染色液购自北京博奥拓达科技有限公司；Trizol 购自日本TaKaRa公司；高分辨率成像系统购自加拿大VisualSonics公司。

1.2 实验动物 清洁级 C57BL ／ 6j 背景的雄性ATM 单倍体基因敲除（ATM+／-）小鼠和同窝野生型（ATM+／+）小鼠各 30 只，10 ～ 12 周龄，体重 24 ～26 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2014-0004。

1.3 动物分组及处理 两种小鼠分别随机分为假手术组和心肌梗死手术组，每组15 只。小鼠急性心肌梗死模型的建立：通过异氟烷吸入麻醉，仰卧固定小鼠四肢，在胸部左侧第3 ～4 肋间隙开胸，用6-0 丝线结扎冠状动脉左前降支，最后用3-0 丝线缝合皮肤。假手术组小鼠仅开胸后缝合。

1.4 心脏超声检测 4 组小鼠分别在假手术或心肌梗死术后7 d，用三溴乙醇腹腔注射麻醉，仰卧固定四肢，用带有30-MHz 超声探头的Vevo 2100 高分辨率成像系统进行超声心动图检测，心率维持在450 ～550 次 ／ min，最后用 VisualSonics Vevo 2100 对图像进行分析。

1.5 心脏组织石蜡切片制备 4 组小鼠分别在假手术或心肌梗死术后7 d，用含肝素的生理盐水灌注心脏，去除心脏中残留血液，剪下心脏，置10%福尔马林中固定，次日在石蜡中包埋心脏组织，Leica 石蜡切片机切片，切片厚度为5 μm，将组织切片置于多聚赖氨酸涂层载玻片上，HI1210 烤片机中60 ℃烤片2 h。

1.6 ATM 单倍体基因缺陷对小鼠心肌梗死后心脏纤维化影响的检测 采用马松三色染色法。将两种小鼠心肌梗死术后7 d 的心脏组织石蜡切片脱蜡至水后，根据马松三色染色液说明书进行染色，尼康ECLIPSE 90i 显微镜采图后，用NIS-Element 软件进行统计分析。

1.7 ATM 单倍体基因缺陷对小鼠心肌梗死后心脏组织中巨噬细胞浸润影响的检测 采用免疫组化染色法。将两种小鼠心肌梗死术后7 d 的心脏组织石蜡切片脱蜡至水后，用柠檬酸抗原修复90 s，羊血清工作液封闭非特异性抗原30 min 以上；切片上滴加小鼠源 MAC2（macrophage alactose-specific lectin-2）单克隆抗体（1 ∶100 稀释），4 ℃孵育过夜；将切片室温平衡30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育30 min；DAB 显色；苏木素染色液进行细胞核染色；梯度酒精脱水后浸泡于二甲苯中透明20 min；中性树胶封片晾干。尼康ECLIPSE 90i 显微镜采图后，用NIS-Element 软件进行统计。

1.8 ATM 单倍体基因缺陷对小鼠心肌梗死后心脏组织胶原合成影响的检测 采用实时荧光定量PCR 法。用Trizol 试剂从4 组小鼠心脏组织中提取总RNA，逆转录为cDNA，以其为模板进行PCR 反应。利用PrimerBLAST 进行设计引物，序列如下：CollagenⅠ上游引物：5′-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3′，下游引物：5′-ATTGGGGACCCTTAGGCCAT-3′；Collagen Ⅲ 上 游 引 物 ：5′-CTGTAACATGGAAACTGGGGAAA-3′，下游引物：5′-CCATAGCTGAACTGAAAACCACC-3′。引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成。反应体系：2 × SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 1 μL，DEPC 水 7 μL，cDNA 1 μL，总体系20 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共 45 个循环。

1.9 统计学分析 采用GraphPad-Prism 7.0 软件进行统计学分析，组间比较采用t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ATM 单倍体基因缺陷对小鼠心肌梗死后心功能的影响 超声结果显示，心肌梗死术后7 d，ATM+／-小鼠射血分数（ejection fraction，EF）和缩短分数（frac-tional shortening，FS）明显低于 ATM+／+小鼠，差异均有统计学意义（t 分别为 2.497 和 2.167，P 分别为0.023 1 和0.048），见图 1。表明 ATM 单倍体基因缺陷加重了心肌梗死后7 d 小鼠的心功能恶化。

图1 超声心动图检测假手术或心肌梗死术后ATM+／-小鼠及 ATM+／+小鼠 EF（A）和 FS（B）的变化Fig.1 Detection of EF（A）and FS（B） of ATM+ ／ - and ATM+ ／+mice after sham operation of MI by echocardiography

2.2 ATM 单倍体基因缺陷对小鼠心肌梗死后心脏纤维化的影响 马松三染色结果显示，心肌梗死术后 7 d，ATM+／-小鼠心脏纤维化水平明显高于 ATM+／+小鼠，差异有统计学意义（t = 2.519，P = 0.0453），见图2 和图3。

2.3 ATM 单倍体基因缺陷对小鼠心肌梗死后心脏组织中巨噬细胞浸润的影响 免疫组化染色结果显示，心肌梗死术后 7 d，ATM+／-小鼠及 ATM+／+小鼠心脏组织中巨噬细胞浸润水平差异无统计学意义（t = 1.331，P = 0.2315），见图 4 和图 5。

2.4 ATM 单倍体基因缺陷对小鼠心肌梗死后心脏组织胶原合成的影响 实时荧光定量PCR 结果显示，心肌梗死术后 7 d，ATM+／-小鼠 collagenⅠ和collagenⅢ mRNA 水平均明显高于 ATM+／+小鼠，差异有统计学意义（t 分别为 10.73 和 3.001，P 分别为 0.000 4 和 0.024），见图 6。

图2 马松三色染色法检测心肌梗死术后7 d 小鼠心脏纤维化水平（× 10）Fig.2 Detection of cardiac fibrosis in mice by Masson trichrome staining（× 10）

图3 心肌梗死术后7 d 小鼠心脏纤维化面积统计Fig.3 Area of cardiac fibrosis of mice 7 d after MI

图4 心肌梗死术后7 d 小鼠心脏组织免疫组化染色的显微镜观察（× 400）Fig.4 Immunohistochemical staining of cardiac tissue of mice 7 d after MI（× 400）

图5 心肌梗死术后7 d 小鼠心脏组织Mac2 阳性细胞数占总细胞数的百分比Fig 5.Percentage of Mac2 positive cells in total cells in cardiac tissue of mice 7 d after MI

图6 实时荧光定量PCR 检测假手术或心肌梗死术后ATM+ ／ -小鼠及 ATM+ ／ +小鼠心脏组织中 collagenⅠ（A）和collagenⅢ（B）mRNA 水平Fig 6.Determination of collagenⅠ（A）and collagenⅢ（B）mRNA levels in cardiac tissue of ATM+ ／- and ATM+ ／+ mice after sham operation or MI by real-time fluorescent quantitative PCR

3 讨 论

ATM 是对DNA 损伤应答的激酶，导致共济失调毛细血管扩张症（ataxia telangiectasia，AT），具有多种炎症表现。ATM 在正常淋巴细胞发育中起作用［8］，参与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）诱导的骨髓树突状细胞（dendritic cells，DC）的发展［9］。本研究发现，心肌梗死术后 7 d，ATM+／-小鼠与 ATM+／+小鼠相比，巨噬细胞浸润无明显差异。心肌缺血诱导心肌氧化应激和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，直接损害细胞成分并导致细胞死亡。此外，ROS 还刺激炎症细胞因子的产生和细胞外基质的降解，促进左心室扩张和心力衰竭［6，10］。ATM 是ROS［3］的重要传感器，同时维持 ROS 平衡［11］。本研究表明，ATM 单倍体基因缺陷加重了心肌梗死后心功能恶化，可能是由心肌梗死后的ROS 失衡导致。

心脏纤维化是许多心脏疾病常见的病理生理学特征，与收缩和舒张功能障碍、心律失常等不良结局有关，心肌纤维化决定心肌梗死后的心脏功能。肌成纤维细胞母细胞介导心肌梗死后的瘢痕形成，分泌细胞外基质组分，包括Ⅰ型胶原α1（collagen type I alpha 1，COL1A1）、Ⅰ型胶原 α2（COL1A2）、Ⅲ型胶原 α1（collagen type Ⅲ alpha 1，COL3A1）和基质金属蛋白酶，从而导致纤维化瘢痕，影响心肌梗死后心功能［12］。本研究结果表明，ATM+／-小鼠心肌梗死后心脏纤维化加重、心脏组织胶原沉积增加。

综上所述，ATM 单倍体基因缺陷加重小鼠心肌梗死后心脏不良重塑，促进心脏纤维化和胶原沉积，但不影响心脏组织中巨噬细胞浸润。