豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制备与活性评价

张 秀，谭正怀，马苗苗，李晓媛，周 雪

豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制备与活性评价

张 秀，谭正怀*，马苗苗，李晓媛，周 雪

四川省中医药科学院，防治重大疾病中药药效学评价平台，四川省中药质量评价重点实验室，四川 成都 610041

通过基因工程技术生产的豆豉血栓溶解酶，研究其安全性及溶栓功效。采用酪蛋白平板从豆豉中分离获得具有纤溶活性的候选菌株，利用基因工程技术将其基因在大肠杆菌BL21（DE3）-pDE1中过表达AprE9912D重组蛋白。经过Ni-NTA纯化柱和透析纯化AprE9912D重组蛋白，体外采用纤维蛋白平板、溶解混合血栓考察溶栓作用，体内采用动静脉旁路血栓模型进行功效评价。同时对其安全性进行初步评估。经过分子鉴定，筛选出具有纤溶酶活性的菌株是贝莱斯芽孢杆菌9912D（9912D）。序列分析发现基因的开放阅读框有382个氨基酸，属于S8家族碱性丝氨酸蛋白，使用SWISS-MODEL同源预测AprE9912D蛋白3D模型。经过Ni-NTA柱纯化，AprE9912D纤溶酶蛋白相对分子质量约为36 000。体外测得AprE9912D纤溶酶酶活力为442.6 kU/mg，2.0 kU/mL AprE9912D纤溶酶就能有效溶解混合血栓，其溶解率为40.0%。在体内，4.0 kU/kg能显著抑制动静脉旁路血栓形成，抑制率为32.9%。体外溶血显示AprE9912D纤溶酶93.0 U/mL时，其溶血率为3.33%；测得小鼠静脉注射AprE9912D纤溶酶半数致死量（LD50）＞102.6 kU/kg。AprE9912D纤溶酶具有活性较强、安全性较高的特点，具有进一步开发的广阔前景。

贝莱斯芽孢杆菌；过表达；安全性；溶栓活性；血栓溶解酶；基因工程技术；大肠杆菌

流行病学研究结果显示，我国心脑血管疾病的发生率不断上升，心脑血管疾病死亡人数大约占人口总死亡数的40%～50%；在欧美，其死亡率更高。血栓是引起心肌梗塞、脑中风的重要原因。治疗血栓有介入、手术、抗凝药和溶栓药等方法。尽管血管支架搭桥技术已经相当成熟，但由于支架引起的再狭窄等不良反应大大限制了支架技术的临床应用。至于抗凝疗法多用于预防，难以起到治疗血栓性疾病的目的[1-2]。

而溶栓药物疗法因具有起效快、操作简单、对患者损伤小、相对价廉等特点而为众多医患所接受。溶栓药发展至今已有3代，其中第1代溶栓药物具有无纤维蛋白特异性、开通率低和易出血等缺点，如尿激酶；第2代溶栓药物则具有半衰期短、颅内易出血和价格贵等缺点，如重组组织型纤溶酶原激活剂t-PA；第3代溶栓药物多采用基因工程制备，具有快速溶栓、半衰期长和开通率高等优点，如瑞替普酶。目前，天然新型溶栓药物如蛇毒、蚯蚓、水蛭素等中药有溶栓作用，虽然价格便宜，但是溶栓效果不佳、有过敏反应等不良反应[1-2]。因此，寻找效果优良、半衰期长、价格低、不良反应小的溶栓药是目前医药科研工作的当务之急[3]。

豆豉为常见的大豆发酵食品。有研究显示豆豉中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等可以产生纤溶酶，对血栓具有溶解作用[4-5]，但这些菌株所产生的酶至今没有走向市场。本实验报道在重庆永川生产的豆豉中发现了一种能产生溶栓酶的贝莱斯芽孢杆菌9912D（9912D），然后利用基因工程技术生产出活性强、安全性高的AprE9912D纤溶酶，为其后期发展奠定了坚实的基础。

1 材料

1.1 菌种及其质粒

豆豉，配料为黄豆，批号为20181113，重庆市永川区嘉泰实业有限公司出品；TreliefTM5α感受态（TSC01）、pClone007载体（TSV-007S）、BL21（DE3）感受态（TSV-A09）以及pDE1表达载体（TSV-E1）均由北京擎科生物科技有限公司出品。

1.2 试剂

酪蛋白琼脂（货号HB0252，批号20180526）购于青岛海博生物公司；牛肉纤维蛋白原（货号FB051，批号514M021）、凝血酶（货号T8021，批号218D0310）、尿激酶（货号U8120，批号715N011）购于北京索莱宝科技有限公司；卡那霉素硫酸盐（kanamycln sulfate，Kan，货号S17025-25 g，批号S09M9Y55277）购于上海源叶生物技术有限公司；-还原型谷胱甘肽（批号EZ3413A111）和-氧化型谷胱甘肽（批号EZ3412C306）购于BioFroxx公司；异丙基-β--硫代半乳糖苷（isopropyl β--1- thiogalactopyranoside，IPTG，货号I6758-1G，批号027M4001V）购于Sigma公司。

1.3 试剂盒

细菌总基因组核酸提取试剂盒（货号D1600，批号20181109），北京索莱宝科技有限公司；蛋白提取试剂盒（货号C600596，批号F708DA0001），BBI Life Sciences Corporation；I-5TM2*High-Fidelity Master mix（货号I5HM-200，MCLAB）、胶回收试剂盒（货号GE0101-50，批号020180516）和质粒提取试剂盒（货号PM0201-50，批号020180508），北京擎科生物科技有限公司；一步法细菌活性蛋白提取试剂盒（货号C500023，批号EC26DA0003），生工生物工程（上海）股份有限公司；Ni-NTA柱（货号DP101- 01，批号N10306），北京全式金生物技术有限公司；SP132572-1m再生纤维素透析袋（截留相对分子质量大小为10 000，批号S10J10G902 19），上海源叶生物技术有限公司；浓缩管10 000 NMWL（货号UFC801096，批号R8NA37711），德国Merck Millipore公司。

1.4 动物

昆明种小鼠，SPF级，四川省中医药科学院动物中心提供，雌雄各半，体质量18～22 g，生产许可证号SCXY（川）2018-19；SD大鼠，SPF级，购买于成都达硕实验动物公司，雄性，体质量220～260 g，生产许可证号SYXK（川）2015-030。

所有动物实验遵循四川省中医药科学院动物福利伦理委员会有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。所有动物均饲养在四川省中医药科学院动物中心SPF动物屏障系统中。环境使用许可证号SYXK（川）2018-100。灯光照明，12 h光照，12 h黑暗。自由饮水、摄食，全营养颗粒饲料由四川省中医药科学院实验动物中心提供。

1.5 仪器

HJ-CJ-2FD双人单面净化工作台，上海沪净医疗器械有限公司；2K15离心机，Sigma公司；LGJ-10冷冻干燥机，北京松源华光科技发展有限公司；S1000thermal cycler PCR仪，美国BIO-RAD公司；DYCP-31D水平核酸电泳仪和24DN垂直蛋白电泳仪，北京六一生物技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 分离、筛选及鉴定纤溶菌株

取豆豉5.0 g加入预置10个无菌玻璃珠的三角瓶中，加入100 mL无菌生理盐水，37 ℃、100 r/min震荡培养72 h[6]。吸取100 μL培养液，用梯度稀释法稀释培养液，采用平板扩散法将不同稀释度（1×10−4、1×10−5、1×10−6）的培养液涂布在酪蛋白平板中上培养、分离菌株，选择有透明圈的菌株，再重复验证1次。

候选菌株用发酵培养基（10 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH 7.2～7.6）37 ℃，200 r/min震荡培养72 h[4,7-8]。离心收集上清液。用酪蛋白平板再次验证候选菌株发酵上清液的纤溶活性，发现有透明圈及颜色由绿变为蓝，说明筛选菌株具有纤溶活性，结果见图1-a。

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取候选菌株基因组DNA，然后采用聚合酶链反应（PCR）扩增候选菌株的基因和基因，S-30 （5’-GTGATCGCAG-3’）单一引物进行随机扩增多态性DNA聚合酶链反应（RAPD-PCR），并与已有基因库序列进行比对分析，种属鉴定[9]，引物序列见表1。

采用引物27-F和1527-R扩增基因，在以下条件下进行PCR：预变性94.0 ℃、5 min；94.0 ℃、30 s，56.3 ℃、30 s，72.0 ℃、1 min 40 s，共35个循环；再延长72.0 ℃、10 min。采用引物recA-F和recA-R扩增基因，在以下条件下进行PCR：预变性94.0 ℃、5 min；94.0 ℃、30 s，52.0 ℃、30 s，72.0 ℃、1 min，共35个循环；72.0 ℃、10 min。RAPD-PCR扩增条件：预变性94.0 ℃、5 min；94.0 ℃、1 min，32.0 ℃、1 min，72.0 ℃、2 min，共40个循环；再延长72.0 ℃、10 min。PCR扩增产物经DNA琼脂糖凝胶电泳分析；DNA核苷酸测序（擎科生物科技股份有限公司完成）；利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）进行基因序列比对（BLAST）分析同源性。

扩增出约1.4 kb的基因同源性分析表明，具有纤溶活性的菌株可能是枯草芽孢杆菌、sp芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌；同源性比对结果均为100%，可以判断属于芽孢杆菌属，但是不能判断出种属。以S-30单一引物扩增结果表明，所有菌株均扩增出1.1、1.5、1.8 kb条带片段，依其方法无法判断筛选菌株是否属于解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌[9]。扩增出约0.9 kb的基因同源性分析表明，筛选出的目标菌株是来自贝莱斯芽孢杆菌，与注释recA蛋白完全一致。综上结果，筛选出具有纤溶活性的菌株为贝莱斯芽孢杆菌。

2.2 AprE9912D基因开放阅读框比对分析

使用I-5TM2*High-Fidelity Master mix，采用401和722-2引物对来自贝莱斯芽孢杆菌的开放阅读框纤溶基因（open reading frame，ORF）进行扩增，引物序列见表1：预变性98.0 ℃、2 min；98.0 ℃、10 s，56.0 ℃、15 s，72.0 ℃、20 s，共35个循环；再延伸72.0 ℃、5 min。纤溶基因DNA序列（结果未呈现）BLAST比对分析，是来自贝莱斯芽孢杆菌9912D菌株。筛选出具有纤溶活性的菌株是为贝莱斯芽孢杆菌9912D，纤溶基因名为基因（ORF）。

在NCBI上对基因（ORF）比对分析。ORF分析：为1个ORF片段，有382个氨基酸（aa）；蛋白功能分析，由信号肽（1-30aa、1-5aa为N区，6-18aa为H区，19-30aa为C区）、肽抑制剂19和成熟肽组成，蛋白为可分泌型，由此判断AprE9912D蛋白主区域在信号肽后面，过表达时选用去信号肽后的主区域，不同于采用信号肽的过表达[10]。蛋白质理化性质分析：蛋白质的分子大小为39 093.10，pI 9.24，去除信号肽后，有352aa，其蛋白质分子大小为35 886.22，pI 8.93；保守区域分析见图2，AprE9912D蛋白，属于碱性丝氨酸蛋白酶，与细胞内碱性丝氨酸蛋白酶S8家族具有高度同源性，活性位点（139、171、213、232、261、328），催化位点（Asp139、His171、Ser328）。

采用网站EMBL-EBI中MAFFT进行氨基酸同源比对，基因（ORF）氨基酸分别与来源于解淀粉芽孢杆菌的（NCBI GenBank: JF739176.1）、（NCBI GenBank: DQ132806.1）和（NCBI GenBank: P00782.1）；与来源于贝莱斯芽孢杆菌的（NCBI GenBank: MH378165.1）和（NCBI GenBank: MN119493.1）；与来源于枯草芽孢杆菌（NCBI GenBank: CAA74536.1）；与来源于纳豆枯草芽孢杆菌（NCBI GenBank: FJ374767.1）进行氨基酸同源比对分析，结果见图3。氨基酸同源比对分析发现其与同源性为98.43%[11]，与同源性为32.60%[12]，与同源性为99.74%，与同源性为99.21%，与纳豆激酶同源性为85.86%，与同源性为85.08%，与同源性为97.12%。使用SWISS-MODEL同源构建AprE9912D蛋白3D模型，结果见图4。

贝莱斯芽孢杆菌9912D与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和纳豆枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌菌属能够产生相似的纤溶酶，而此类纤溶酶具有较多相似特点：属于AprE类型碱性丝蛋白；有高度相似的氨基酸序列；同源S8家族蛋白；相似的催化位点、蛋白结构和功能特性；成熟肽相对分子质量大约是27 000～29 000[13-14]。

2.3 AprE9912D纤溶酶基因过表达

使用I-5TM2*高保真缓冲液，采用Pro490和722-2引物对来自贝莱斯芽孢杆菌包含前导肽和成熟肽的基因进行扩增，扩增条件同基因（ORF），引物见表1。扩增产物1.1 kb构建Trelief5α-pClone007-AprE9912D重组转化子。经抗生素筛选、酶切、PCR扩增外源片段、测序和NCBI BLAST比对分析后鉴定重组转化子是否正确。

采用高纯度质粒DNA提取试剂盒提取目标pClone007质粒。使用Pro490-pDE1和722-2-pDE1引物扩增目的基因，引物序列见表1。目的片段经纯化后插入大肠杆菌BL21（DE3）pDE1，采用热休克处理转化外源质粒。大肠杆菌BL21（DE3）pDE1-AprE9912D重组转化子经抗生素Kan筛选、PCR扩增外源片段、测序和NCBI BLAST比对分析后鉴定重组转化子是否正确。纤溶酶基因包括前导肽和成熟肽，采用启动子启动表达，6*His标签筛选表达蛋白。重组大肠杆菌BL21（DE3）pDE1-AprE9912D构建图，如图5，获得基因过表达菌株。

单克隆菌落大肠杆菌BL21（DE3）-pDE1- AprE9912D经过活化和扩大培养，菌液浓度在600 nm处的吸光度达到0.6～0.8时，添加0.6 mmol/L IPTG，20 ℃诱导培养20 h[13,15-16]。收集菌体，用PBS缓冲溶液冲洗菌体3次。采用细菌蛋白提取试剂盒提取活性可溶性蛋白，一步法提取试剂盒处理细菌包涵体。SDS-PAGE电泳分析可溶蛋白及包涵体蛋白相对分子质量，见图6。

2.4 AprE9912D纤溶蛋白纯化与复性

结合Ni-NTA柱，对“2.3”项所述方法获得的包涵体和可溶性蛋白，进行分离、纯化和透析法复性[14,17-18]，结果见图7。经SDS-PAGE电泳分析AprE9912D纤溶酶的相对分子质量为36 000，如图6。采用纤维蛋白平板法测定纤溶酶纤溶活性，纤溶活性表示为kU/mg蛋白，孔中分别加入不同浓度的AprE9912D纤溶酶，37 ℃孵育16 h。以尿激酶为标准品，用透明圈大小制作标准曲线计算纤维酶活性。以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，用Bradford法测定蛋白浓度。在纤维蛋白平板上发现都具有纤溶活性，纤溶酶酶活力为442.6 kU/mg，如图1-b。纤维蛋白平板有2种形式鉴定纤溶活性：无纤溶酶原和富有纤溶酶原。没有纤溶酶原平板适合于鉴定类纤溶酶活性，富有纤溶酶原平板适合于鉴定类纤溶酶原激活剂，而本试验条件下发现AprE9912D纤溶酶属于类纤溶酶[4,19]。AprE9912D纤溶酶液体经真空冷冻干燥机干燥成粉末，供后续试验使用及验证其安全性和溶栓功效[17-18,20]。

2.5 溶栓功效评价

2.5.1 体外对混合血栓的影响 采用雄性大鼠腹主动脉取血制备混合血栓[21]。将混合血栓切成103.0～116.0 mg的血块，根据混合血栓质量随机分为3组：对照组、AprE9912D纤溶酶组和尿激酶组。在等反应体系条件下，AprE9912D纤溶酶组的试管中分别添加AprE9912D纤溶酶，浓度分别为0.5、1.0、2.0 kU/mL；尿激酶组的试管中添加尿激酶，浓度为2.0 kU/mL；对照组的试管中添加0.5 mL生理盐水，37 ℃孵育16 h。试验结束时，取剩余血栓在滤纸上吸去水份，称质量[22-25]。溶栓率（）计算公式为＝(0－1)/0，其中0为初始血栓的质量，1为残余血栓的质量。平行试验3次。与对照组相比，AprE9912D纤溶酶2.0 kU/mL可显著溶解血栓，减轻混合血栓质量，差异具有统计学意义，溶栓率为40.0%，结果见表2。

2.5.2 体内对动静脉旁路形成血栓的影响 结合“2.5.1”项体外对混合血栓的溶解情况，故体内验证实验采用4.0 kU/kg的剂量。取雄性SPF级SD大鼠（220～260 g），根据体质量随机分为模型组、尿激酶组和AprE9912D纤溶酶组，分别尾静脉注射尿激酶4.0 kU/kg、AprE9912D纤溶酶4.0 kU/kg或等量生理盐水。10 min后，用动静脉导管制备动静脉旁路血栓模型，体外循环15 min，取出血栓线，立即称定质量[26-28]，总质量减去6 cm干缝合线质量即得血栓质量。血栓率（）计算公式：＝(0－1)/0，其中0为模型组血栓质量，1为药物组血栓质量。与模型组相比，AprE9912D纤溶酶4.0 kU/kg可以显著性抑制大鼠动静脉旁路血栓形成，血栓形成抑制率为32.9%[27-29]，结果见表3。

与对照组比较：**＜0.01***＜0.001

**< 0.01***< 0.001control group

与模型组比较：**＜0.01

**< 0.01model group

2.6 安全性评估

2.6.1 静脉注射对小鼠急性毒性作用 经预试验发现其急性毒性作用甚小，无法测出其半数致死量LD50，故测定其最大耐受量。正式实验时，取SPF级18～22 g昆明种小鼠20只，雌雄各半，随机分为对照组和实验组。在禁食不禁水16 h后，实验组分别尾静脉注射AprE9912D纤溶酶（102.6 kU/kg），对照组给予等量生理盐水。观察并记录给药后14 d内动物的中毒情况[5,26]。分别于第7天和第14天称定质量，2周后用脱臼法处死未死动物，称量心、肝、脾、肾、肺等脏器的湿质量，按照公式计算脏器指数。

脏器指数＝组织湿质量/体质量

小鼠在给药后2周内，未出现死亡或行为学、排泄物、分泌物等异常现象，解剖时肉眼未见各主要器官异常。从表4、5可见，AprE9912D纤溶酶对小鼠体质量、脏器指数等指标无明显影响，与对照组比较差异无统计学意义。AprE9912D纤溶酶半数致死量（LD50）＞102.6 kU/kg。

2.6.2 体外溶血作用 溶血性测定采用改进的2019版中国药品检验标准操作规范化学药部分—溶血与凝聚检查法[30]。从大鼠腹主动脉取血，玻璃珠去除纤维蛋白原后，生理盐水清洗3次。采用生理盐水稀释成2.0%红细胞悬液用于试验，每支试管中添加2.5 mL红细胞悬液，随机分为3组：阳性组、AprE9912D纤溶酶组和阴性组。在等体积的条件下，取不同浓度的AprE9912D纤溶酶分别添加到2.5 mL红细胞悬液中，用生理盐水补足5.0 mL；阳性组加入2.5 mL蒸馏水；阴性组加入2.5 mL生理盐水。37 ℃水浴3 h，每30 min观察溶血及凝聚情况。3 h后收集上清液，检测波长540 nm处吸光度（）值，溶血率按公式溶血率＝(样本－阴性)/(阳性－阴性)计算。重复3次溶血实验。

经过3 h观察，2.0%红细胞悬液在体外添加AprE9912D纤溶酶之前或之后没有明显的溶血及聚集现象。AprE9912D纤溶酶最大浓度为93.0 U/mL时，溶血率为3.33%，结果见表6。溶血率不超过5.0%，与中国国家医药产品管理局《中华人民共和国医药行业标准》和《中国药典》2020年版相符。

2.7 统计方法

3 讨论

目前，临床上常用溶栓酶存在有不良反应问题，如蝮蛇抗栓酶具有较强的抗原性，引起患者产生过敏反应，干扰治疗效果[31]。其次，这些酶剂量难以把握，剂量过小，溶栓效果不佳，影响愈后；剂量稍大，则可引起出血，严重者可给患者带来生命危险。再次，这些药品普遍存在价格高，许多患者家庭难以承受。因此，积极寻找溶栓效果好、安全性高的溶栓药物，是许多国内外制药大公司追求的目标之一。

豆豉是人们喜爱的食品，早期有人发现豆豉中含有调血脂成分[32]，但由于含量甚微，无法用于临床；近年来，有报道显示豆豉所含的枯草芽孢杆菌具有产生溶栓酶的作用，但由于其含量甚低[33]，无法实现直接从豆豉中提取、分离溶栓酶的目的。本研究首次发现豆豉中所含贝莱斯枯草芽孢杆菌9912D同样具有很好的溶栓活性[11-12]，但常规状态下，含量甚微，难以实现用于临床治疗血栓性疾病的目的。因此，本实验在确定其基因序列的基础上，采用基因工程技术，使大肠杆菌大肠杆菌BL21（DE3）-pDE1过表达基因，初步实现了使用较低的成本可以大量生产具有溶栓活性的AprE9912D酶的目的，体内外活性研究结果显示AprE9912D酶具有溶栓活性高、无溶血等不良反应。初步研究表明AprE9912D酶具有价廉、活性强且安全的特点，初步克服了目前市场上溶栓酶的诸多不确定，提示其广阔的应用前景。

−：没有作用；＋：有作用

−: no; ＋: yes

当然，本实验在后续研究中还有许多地方有待进一步完善：如分离纯化技术的效率较低，相关参数不能与工业化生产接轨，目前还不能实现工业化大生产，因此有必要在后期研究中进一步引进高效的分离、纯化技术，使其与工业化大生产接轨；其次，其安全性评价也有待进一步完善，特别是需要回答该药的致敏性问题；在药效学研究中也有待进一步深入研究，特别是其溶栓机理或特点有待进一步系统阐述，以准确回答其成药性问题。

综上所述，在本实验条件下，通过基因工程产生的AprE9912D纤溶酶作为一种天然新型溶栓剂，克服了豆豉中含量少、不能静脉注射实现快速溶栓的缺点，大大提高了其临床应用前景；同时与目前临床上常用治疗血栓的药物尿激酶比较，具有纯化质量高、溶栓活性好、无明显不良反应等优点。其详细作用机制有待深入研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Preparation and fibrinolytic activity evaluation of thrombolytic enzyme AprE9912D from Douchi

ZHANG Xiu, TAN Zheng-huai, MA Miao-miao, LI Xiao-yuan, ZHOU Xue

Sichuan Key Laboratory of TCM Quality Evaluation, Evaluation Platform of Pharmacodynamics of TCM for Major Disease Prevention and Treatment, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China

To study safety and thrombolytic effect of Douchi thrombolytic enzyme produced by genetic engineering technology.Acandidate strainwith fibrinolytic activity was isolated and obtained from Douchi by casein plate.gene of the candidate strain was expressed inBL21 (DE3) - pDE1 to produce the recombinant protein AprE9912Dby genetic engineering technology. This protein was purified by Ni-NTA column and dialysis, the fibrin plate and dissolution of themixed thrombus were using for observing the thrombolytic effect; The rat arteriovenous shunt thrombosis modelwas used for efficacy evaluation. At the same time, the safety was evaluated preliminarily.The strain with fibrinolytic activity from screening was9912D bymolecularidentification. Sequence analysis indicated thatthe open reading framework ofgenehad 382 amino acids, and belonged to a S8 family Alkaline serine protease; three-dimensional structure of AprE9912D protein was predicted by SWISS-MODEL. The protein molecular weight of AprE9912D fibrinolytic enzyme was 36 000 after purification by Ni-NTA column. Fibrinolytic activity of AprE9912D enzymewas 442.6 kU/mg; 2.0 kU/mL AprE9912D fibrinolytic enzyme could dissolve mixed thrombus effectively, and the thrombolytic ratio was 40.0%., 4.0 kU/kg AprE9912D fibrinolytic enzyme could significantly inhibit thrombosis in the rat arteriovenous shunt thrombosis model, the inhibition ratio was 32.9%., thehemolysis test showed that when the concentration of the AprE9912D fibrinolytic enzyme was 93.0 U/mL, the hemolysis ratio was 3.33%. The median lethal dose (LD50) of the AprE9912D fibrinolytic enzyme was greater than 102.6 kU/kg by iv.The AprE9912D fibrinolytic enzyme has stronger activity and higher safety.It would have broad prospects for further development.

; overexpression; safety; fibrinolytic activity; thrombolytic enzyme; genetic engineering technology;

R283.6

A

0253 - 2670(2021)02 - 0367 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.009

2020-08-18

四川省科技厅基本业务专项（A-2018N-27）；四川省中医药管理局科学技术研究专项项目（2018QN040）

张 秀（1986—），女，硕士，助理研究员，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail: 771428588@qq.com

谭正怀，男，博士，研究员，主要从事中药药理与毒理研究。E-mail: tanzhh616@sohu.com

[责任编辑 郑礼胜]