企业微生物实验室能力验证的质量控制

张艳霞，萧慧珍，于晓君，黄少云，房树超

（完美（广东）日用品有限公司，广东中山 528454）

“人、机、料、法、环”是全面质量管理理论中影响质量的五个主要因素的简称[1]。对于微生物检测而言，分别指检测人员、仪器设备、培养基和试剂、检测方法和环境设施条件。

从这5个主要因素探讨微生物实验室能力验证的质量控制，确保检测结果的准确性和有效性的同时提高检测人员对病原菌检测鉴定的技术水平，有助于实验室发现和纠正自身存在的问题，促进微生物检测向着更精确、更规范的方向发展。

1 检测人员

微生物检测涉及一系列复杂的系统工作，检测人员的检测技能、对检测关键点的掌握以及操作的熟练程度对检测结果的准确性具有直接影响。因此，检测人员首先应具备微生物知识背景并持证上岗，具有高度的责任心和严谨认真、实事求是的工作态度，其次要具备扎实的业务能力和娴熟的操作技术，能够正确理解相关标准并规范地实施检测。

能力验证时，应安排责任心强、严谨、实际操作经验丰富、具有较强分析问题和解决问题能力的人作为主检人员，新进人员在主检人员的指导和监督下，使用剩余样品进行平行实验，实现实验室人员比对的同时，有效锻炼和考察新进人员的检测能力，避免偶然误差的发生。

2 仪器设备

微生物实验室检测用的关键设备包括生物安全柜、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅和培养箱等，应按照国家相关法律法规要求对仪器进行检定、校准或期间核查。日常检测应正确操作仪器，做好日常保养维护和使用记录，关注仪器的稳定性，防止仪器在检测或培养过程中发生故障，减小仪器带来的误差并方便溯源。

2.1 高压蒸汽灭菌锅

作为检测用品灭菌的关键设备，高压蒸汽灭菌锅的压力表应按规定定期送专业检定单位进行强检，定期对灭菌温度进行校准确认并使用生物指示剂进行期间核查。每次灭菌时使用化学或物理指示剂确认灭菌有效性。实验室应配备针对污染物灭菌的专用高压灭菌锅，避免交叉污染。另外，操作人员需经专业培训并持证上岗，严格按照高压灭菌锅说明书进行操作。

2.2 培养箱

培养箱温度的均匀性和温度偏差对微生物生长具有较大影响，应定期进行使用温度的校准和期间核查。日常监控中，应定期对培养箱进行高温或消毒剂熏蒸消毒，并采用沉降菌或浮游菌检测的方式对消毒效果进行确认；温度监控可采用温湿度记录仪或无线温度探头等方式记录和保存温度数据，防止培养过程中培养箱发生故障，温度出现失控。

3 培养基和试剂

微生物检测用培养基、试剂、质控菌株和样品是微生物检测中不可缺少的一部分，对微生物繁殖、活力保证与鉴定等方面具有十分重要的影响。

3.1 培养基和试剂

培养基是人工配置的满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质，其质量的好坏直接影响微生物检测数据的准确性。

培养基和试剂到货后，应先检查产品合格证明、包装的完整性和质控报告，符合要求的按GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检测 培养基和试剂的质量要求》进行包括物理性状等基本要求、微生物污染和微生物生长特性等技术性验收。培养基应严格按供应商提供的储存条件、有效期和使用方法进行配制、灭菌、保存和使用。已开封的培养基应进行开封后使用有效期的验证。另外，由于培养基复融可能导致其性能下降，故应尽量避免使用复融的培养基。

微生物检测用培养基以商业化脱水合成培养基和即用型培养基最为普遍，虽然其具有方便快捷的优势，但不同生产企业的原料成分、生产工艺与质量方面差别，导致其在微生物检测过程中的增菌效果或生化反应存在一定的差异，因此建议同时储备两个或以上合格生产商的培养基以备质控需要。

3.2 质控菌株

质控菌株是购买微生物菌种保藏专门机构或同行认可机构保存的、可溯源的标准或参考菌株。质控菌株在能力验证中主要用于培养基质量验收、阴阳性对照和实验室内部质控等。质控菌株在购回后，按相关要求进行验收和合理保藏，其传代、复苏、保藏和使用需做好相应的记录，使用时应保证始终处于受控状态。另外，应定期对菌株进行菌种活力核查，活力衰退的菌株应及时做无害化处理，保证质控菌株的有效性。

3.3 样品的检查与确认

接收到能力验证样品后，应按能力验证指导书的要求，核对样品数量，检查样品外包装和性状。若样品出现不能满足指导书要求等任何疑问，应及时联系组织方，必要时申请重新发样。经确认的能力验证样品，应按要求储存并在规定时限内检测。

4 检测方法

4.1 检测方法的选择

实验室应优先按能力验证组织方指定/推荐的检测方法进行检测，若组织方推荐多个测试方法，要考虑不同测试方法对结果的影响，一般推荐优先采用第一法。若组织方无指定检测方法，可采用实验室经认可的方法或国际通用方法。

4.2 制定实验方案

能力验证过程受多种因素影响，检测人员在操作过程中难免存在对检测关键点管控不当和操作不到位等情况，因此在能力验证开展前，检测人员应根据检测方法和能力验证组织方提供的指导书要求，拟定检测操作流程和识别检测项目的关键控制点，针对检测过程中可能出现的问题，列举操作细节的注意事项和相应的质控措施，整理输出实验方案。检测过程中依据实验方案开展检测，保障能力验证有序规范开展和检测结果的准确可靠。

4.3 依据组织方的指导书复苏样品

冷藏条件会对样品中菌体造成应激损伤，若样品的复苏不彻底或不均匀，受损菌体生物学特性未得到恢复，将削弱或抑制菌体在培养基上的生长能力，严重时会直接影响实验结果，因此要严格按照组织方的指导书要求在规定时限内对样品进行预处理，防止样品中原有微生物发生变化。复苏后的样品应立即进行检测，避免样品中微生物在放置过程中由于环境或其他因素的影响而大量死亡。

能力验证检测过程应设置平行样和阴阳性对照，保证实验结果的准确性。阴性对照能防止因人为操作不当或培养基和检测用品灭菌不彻底等因素造成的检测结果不准确，而阳性对照有助于更好地判断实验效果和目标菌的形态特征。

4.4 定量项目

定量方法是对一定数量的样品进行直接或间接测量被分析物数量的分析方法。一般采用实验室人员对比和同一检测人员的平行样检测等方式以提高检测结果的准确性。

微生物能力验证常见定量项目有菌落总数、霉菌、酵母菌、大肠菌群（MPN计数法和平板计数法）、金黄色葡萄球菌（平板计数法）和乳酸菌计数等，其检测应考虑样品处理、稀释过程、加样体积、培养基倾注、培养观察以及菌落计数和结果报告等因素的质量控制。

4.4.1 样品处理

以安瓶粉末为基质的能力验证样品，对西林瓶内容物进行水化时，应尽可能将原液吸出后，多次润洗瓶内壁，防止滴、漏、溅、洒。

以颗粒状玉米等为基质的样品，在称量前需充分混匀，样品称量和稀释后建议使用均质器拍打，使样品中微生物均匀分布于稀释液中。

4.4.2 样液稀释和加样体积

能力验证时，在不清楚样品适宜稀释度的情况下，建议最少做6个稀释梯度。样液和稀释液的混匀建议使用漩涡混匀器，在3 000 r/min下混合液漩涡至底后约3 s，保证混合均匀。因微生物繁殖速度快，检测时间一般控制在15 min内完成。

菌落总数项目可考虑在培养基中添加TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）或使用3M测试片（由美国3M公司研制的微生物快速测试试纸）法等进行平行测试，提高计数结果的准确性。

检测用的稀释液建议灭菌后使用校准合格的无菌瓶口分液器进行分装，降低高压蒸汽灭菌对分装后稀释液体积的影响。灭菌后的瓶口分液器使用前需进行分液准确性的核查。使用移液器或玻璃移液管移液时，应注意按方法正确操作，移液器在使用前应进行移液准确性核查，确保加样体积的准确性。

4.4.3 培养基倾注和培养观察

培养皿加入样品液后应尽快倾注温度在46～48 ℃的培养基并摇匀。培养基温度过高可能导致菌体死亡使计数数值偏低。培养基倾注的厚度要适宜，过薄会导致培养基在培养过程中水分过度蒸发出现干燥失水现象，菌落的生长发育缺乏充足的水分和营养供给，将导致计数结果不准确。

为防止培养的过程中菌落蔓延或菌落延缓生长对菌落计数的影响，可适当提前观察计数或延长培养时间。

4.4.4 菌落计数和结果报告

同一检测项目不同检测方法对平板中菌落的适宜计数范围、结果的计算方法以及报告的修约原则等要求有所不同，应按照检测方法要求计数并出具最终结果。平板计数时应采取双人计数，计数结果差异在10%以内判断为结果一致[2]。

4.5 定性项目

定性方法是用直接或间接的方法检测被分析物是否存在的分析方法。微生物定性检测项目较多，常见的食品定性项目有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157等；化妆品定性项目有耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等。定性项目的检测关键点主要是划线分离、可疑/典型菌落的选取和生化鉴定。

4.5.1 划线分离

对样品进行前处理后，应按检测方法要求的温度和时间培养，如方法的培养时间是一个范围，应选择接近终止的时间点结束培养并进行下一步操作，避免提前结束培养造成漏检。有必要时可考虑使用能力验证样品原液在选择性平板上划线分离，为后续增菌液的选择性平板划线分离结果提供参考。

增菌液培养结束后，同一瓶增菌液在同一种选择性平板上应至少划线3块。同一种选择性平板，应设置划线操作过程接种环不灭菌和接种环划线第二区域前进行灭菌或更换接种环两种接种方式的对比，以确保目标菌得到有效分离，避免增菌液中杂菌含量过高，目标菌在选择性平板中被杂菌覆盖造成漏检。

4.5.2 可疑/典型菌落的选取

不同定性项目对选择性平板中可疑/典型菌落生化鉴定的菌落数要求不一样，如GB 4789.36-2016对大肠埃希氏菌O157要求分别挑取5～10个可疑菌落，而GB 4789.4-2016对沙门氏菌则要求分别挑取2个以上典型/可疑菌落进行初步生化鉴定。应按检测方法要求选取足够数量的典型/可疑菌落进行后续的生化鉴定。若方法要求的选择菌落数是一个范围，应以最大选择数为准，防止漏检的同时提高检测效率。

挑取的可疑/典型菌落建议先接种TSA平板，从培养后的TSA平板上挑取菌落进行后续的生化鉴定，确保后续生化鉴定项目结果来自同一个单菌落，同时排除选择性平板上菌落的颜色反应对生化鉴定的干扰。

4.5.3 生化鉴定

为保证检测的准确性和高效性，可疑/典型菌落应按方法规定的鉴定流程先进行初步生化鉴定，筛选出目标菌落再进行后续鉴定。若检测项目较多且样品量较大，一旦某个样品已明确阳性结果，应尽快结束相关实验，将主要精力放在疑难样品上。

4.5.3.1 阴阳性对照

生化实验需要使用质控菌株作阴阳性对照时，应按检测方法要求使用相应或等效菌株，否则将影响生化实验结果的判断，最终影响到能力验证结果。

GB 4789.36-2016中 的MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷）实验要求使用大肠埃希氏菌ATCC 25922或等效标准菌株作阳性对照。在检测时，本实验室检测人员发现实验室保藏的大肠埃希氏菌ATCC和大肠埃希氏菌8099能分解MUG产荧光，MUG实验结果阳性，而大肠埃希氏菌ATCC 8739则不产荧光，MUG实验结果阴性。实验结果表明，大肠埃希氏菌8099可作MUG实验阳性对照的等效标准菌株，而大肠埃希氏菌ATCC 8739则为非等效菌株，若使用ATCC 8739作MUG实验阳性对照菌株，将导致实验结果误判。因此，在日常检测和能力验证时，应注意正确选择生化实验阴阳性对照菌株，排除非等效菌株对实验结果的干扰。

4.5.3.2 血清学实验

在生化鉴定项目中，血清学实验和动力实验难度较大。林秀敏等[3]的文章中指出，菌落分离纯化培养基对菌体抗原和鞭毛抗原诱导有一定影响，Swarm软琼脂对鞭毛抗原具有很好的诱导效果，能使发育不良或暂时缺失的鞭毛抗原得以恢复，且容易挑取培养物，可操作性强，能很好地解决半固体平板培养物难以挑取的问题。

在日常检测中，使用半固体琼脂上的大肠埃希氏菌O157：H7 NCTC 12900和CICC 21530标准菌株培养物做H7因子血清学实验时，常出现培养物挑取可操作性差，凝集效果不明显或需多次连续接种的问题。使用Swarm软琼脂进行平行实验时，Swarm软琼脂上培养物容易挑取，第一次接种的培养物H7因子血清均凝集且效果明显。因此，血清学实验或动力学实验可使用Swarm软琼脂代替半固体琼脂，提高实验效率。

5 环境设施条件

实验环境是保障微生物结果可靠的前提，能力验证开展前，洁净室应进行彻底消毒，有效地保证生物安全柜的无菌环境，排除外界微生物污染样品的风险和不受其他有害因素的影响。保证实验室温度、湿度等环境条件符合检测要求。

能力验证过程中，须严格落实无菌操作，防止能力验证样品之间、环境与样品之间以及样品和阳性对照之间的交叉污染。同时应设置空白对照，阳性对照实验则安排在所有能力验证样品操作完毕后。若条件允许，不同的样品在不同的生物安全柜内操作，若在同一生物安全柜内操作，不同样品逐个操作并做好样品操作间隙的消毒杀菌工作。

6 结语

能力验证是利用实验室间比对考察实验室检测能力的重要手段，不仅能有效监控实验室的检测过程，证明其检测数据的可靠性，更有助于实验室发现和纠正自身存在的问题，识别实验室间的差异，指导实验室持续提高技术能力和管理水平。企业微生物实验室应积极参与国内外能力验证，认真研读能力验证组织方的技术报告，获取同一检测项目不同检测方法间差异的信息，同时关注本实验室能力验证结果在技术报告中的Z值[4]，有必要时对该项目进行风险评估，识别出随机误差、系统误差或人为错误等导致的问题并采取相应的预防措施，使能力验证结果得到正确的总结和应用，进一步提高实验室的分析和检测能力，提升实验室在行业内的竞争力和影响力。