颗粒酶A在肿瘤细胞中的表达分析

张涛

（中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏南京 211198）

颗粒酶（GZMs）是丝氨酸蛋白酶的一个亚家族，目前为止已经发现有5种人类颗粒酶（A、B、H、K和M）和11种小鼠颗粒酶。人类颗粒酶基因分别位于3组染色体，其DNA同源性在57%～61%[1]。这些颗粒酶不仅可以在细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）中表达，在嗜中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞和巨噬细胞中也有表达[2]。研究发现，颗粒酶B在膀胱癌中表达，影响样本的上皮间质转化和侵袭能力[3]；颗粒酶M在白血病细胞和实体瘤细胞系（Hela）中表达，促进了肿瘤的生长和转移，诱导癌细胞上皮间质转化[4]；颗粒酶A在CTL和NK细胞中表达，主要介导穿孔素依赖的细胞毒性作用，该途径通过将细胞毒性颗粒的内容物递送至靶细胞表面来发挥作用。尽管已经对淋巴细胞中颗粒酶A介导的细胞死亡进行了深入研究，但近年来的相关研究也表明了颗粒酶A可以在卵巢颗粒细胞等非淋巴细胞中表达[5]，具有区别于细胞毒性的其他作用。

1 颗粒酶A概述

颗粒酶A是细胞中含量最多的一种颗粒酶，人们对其的表达加工、晶体结构和底物特异性等已经有了较为清晰的了解。人颗粒酶A基因位于人类的第5号染色体5q11～q12处，表达的颗粒酶A有α和β两种亚型，α亚型由262个氨基酸组成，分子量为29 kD，前26个氨基酸为N端信号肽，第27和28个氨基酸为活化肽[6]；β亚型由245个氨基酸组成，分子量为27 kD。颗粒酶A的特异性主要取决于4个位点的氨基酸，即Leu217、Glu218、Asn219-A和Gly226[7]，在蛋白精氨酸（Arg）或赖氨酸（Lys）位点后裂解底物。与颗粒酶B不同，颗粒酶A以含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）非依赖的方式杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。

2 颗粒酶A的表达

颗粒酶的表达通常仅限于淋巴谱系的细胞，CTL和NK是已知的组成性合成和存储颗粒酶的免疫细胞。颗粒酶在嗜中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞和巨噬细胞等细胞中也表达，但此类细胞可能需要刺激才可诱导表达。CTL细胞和NK细胞中合成加工后的颗粒酶被储存在pH为5.5的分泌性颗粒（SGs）中[8]，确保其在杀伤细胞内没有活性，以保护其不破坏宿主细胞。

近年来的研究表明，在某些形式的刺激下，颗粒酶也可以在非淋巴细胞中表达。受到卵泡刺激素的刺激后，卵巢颗粒细胞中的颗粒酶A表达上调。在IL-3刺激的嗜碱性粒细胞和IgE激活的体外肥大细胞、紫外线A和紫外线B照射的角质形成细胞以及人的胎盘和睾丸支持细胞中均检测到颗粒酶B的mRNA[9]。有实验表明，颗粒酶甚至在多种肿瘤细胞中有所表达，如颗粒酶B在乳腺癌、肺癌、尿路上皮癌和口腔鳞状细胞癌中均有表达；颗粒酶M在白血病细胞和实体瘤细胞系（Hela）中表达。颗粒酶A在乳腺癌细胞中切割了SET蛋白以及PARP-1蛋白，推测肿瘤细胞可能微量表达颗粒酶A，但这一推测还有待试验验证。

3 颗粒酶A的激活与抑制

与其他丝氨酸蛋白酶相似，颗粒酶的加工通过两步过程激活，所有的颗粒酶最初都被合成为无活性的前体分子。（1）根据颗粒酶A前体分子上的前导序列将前体分子运输至内质网和高尔基体，除去前导序列，保留该蛋白氨基末端的一个二肽[10]。（2）无活性的颗粒酶A被运送至分泌性颗粒中经二肽基肽酶I（DPPI）裂解二肽转化成有活性的颗粒酶A。DPPI又称组织蛋白酶C，负责在颗粒酶A的激活过程中裂解二肽，是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，属于木瓜蛋白酶超家族。研究发现，DPPI在多种恶性肿瘤中表达上调，包括鳞癌、胰腺癌和乳腺癌[11]。

颗粒酶蛋白水解活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员的调节。丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpins）是一个大的蛋白酶抑制剂家族，可以通过共价不可逆的方式结合到酶活性位点上，或者通过形成非常紧密的非共价复合物来使其靶向失活。丝氨酸蛋白酶抑制剂B12（Serpin B12）是人类细胞内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂之一[12]，也是颗粒酶A的缓慢结合抑制剂，该机制依赖于Serpin B12结构中RSL（Reactive-Site Loop）反应中心的Arg和丝氨酸（Ser），颗粒酶A在Arg和Ser位点后切割RSL，使得Serpin B12折叠的张力减弱，导致主要的构象发生重排，进而使得颗粒酶A活性位点被扭曲，并将其困在与抑制剂共价的复合物中。

此外，颗粒酶A被两种胰蛋白酶抑制剂α-2巨球蛋白和抗凝血酶Ⅲ结合并不可逆地抑制。第3种颗粒酶A抑制剂是胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂（PSTI）[13]，在患有炎症和组织破坏的患者血液中被发现。整体上来看，主要是在CTL细胞和多种靶标细胞中鉴定了颗粒酶A的抑制剂，鉴定其在表达颗粒酶的肿瘤细胞和非淋巴细胞中的表达需要尽早完成。

4 颗粒酶A在肿瘤细胞中潜在的生理功能

研究表明，肿瘤细胞中有各种蛋白酶的表达，如基质金属蛋白酶（MMPs）、组织蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）等己经被证明在肿瘤的发生和进展中发挥了重要作用。这些蛋白酶类参与了肿瘤对基底膜的降解并促进了肿瘤从原发部位的脱离进而导致肿瘤的侵袭和转移。但关于颗粒酶在非淋巴细胞内和肿瘤细胞中表达的研究并不多，对于其功能的探讨更是少之又少。目前，对于颗粒酶A的功能研究，主要集中于其在淋巴细胞中表达所具有的细胞毒性作用以及可能的促炎作用。颗粒酶A通过对NDUFS3、SET复合物组成部分等底物的切割，诱导染色体DNA产生不可修复的损伤，最终导致靶标细胞死亡[14]。淋巴细胞表达颗粒酶A时，颗粒酶A底物非常丰富且具有特异性，对底物的切割是颗粒酶发挥作用的主要机制。在核内其可以裂解SET复合物中的多种组分，如核小体组装蛋白、剪切相关蛋白、多种转录因子以及组蛋白。

4.1 与肿瘤迁移相关

颗粒酶A在肿瘤细胞中的表达可能与肿瘤的上皮间质转化（EMT）和侵袭迁移有关。2010年，Donatella等[3]发现膀胱癌中表达的颗粒酶B与样本的上皮间质转化相关，而且能促进尿道癌细胞的侵袭能力。另外，2015年有研究表明颗粒酶M在白血病细胞和实体瘤细胞系（Hela）中表达，促进了肿瘤的生长和转移，诱导癌细胞上皮间质转化，并与STAT3的激活相关[4]。

Gomes等人[15]对乳腺癌等肿瘤的最新研究表明，在肿瘤发生过程中，组蛋白变体H3.3作为肿瘤细胞命运的主要调节因子被整合到染色质中，诱导促转移的转录重编程，是肿瘤进展和侵袭中至关重要的组分。有研究表明，在星状孢子素诱导的淋巴瘤细胞（Raji细胞）死亡过程中，组蛋白H3在体内被颗粒酶A裂解[16]。组蛋白变体H3.3作为颗粒酶A的底物，则可能在这一过程中被调节，从而影响肿瘤的进程和侵袭表型。SET是一种参与多种细胞过程的多功能癌蛋白，在肿瘤发生和转移中起着重要作用。NM23H1是一种DNA酶和肿瘤转移抑制因子，而SET能够与NM23H1结合，并抑制其活性。SET的蛋白水解或拮抗将逆转对NM23H1的抑制，所以颗粒酶A对于SET的切割同样可能影响肿瘤的迁移。

4.2 影响肿瘤细胞的基因表达

组蛋白是细胞染色质中的碱性蛋白质，和DNA共同组成核小体结构，是染色质的主要蛋白质组分，并在基因表达调控中发挥非常重要的作用。颗粒酶A的众多底物中则包括组蛋白H1、H2B、H3和H4，其中颗粒酶A对组蛋白H3和H4的切割也已经在Raji细胞中被证实[17]。颗粒酶A对组蛋白的切割通常被认为是诱导靶细胞凋亡的机制，但其在肿瘤细胞中所扮演的角色可能并非仅仅如此。颗粒酶A对组蛋白底物的切割可能会改变染色质的开放状态，进而影响基因的表达调控。

颗粒酶A对于SET复合物的切割是颗粒酶A介导caspase非依赖的凋亡途径的主要机制，这一过程涉及众多底物，包括SET复合物的组成成分SET、pp32、Ape1和参与SET复合物组装和转录激活的HMG2等。SET同时也是激素受体介导的基因表达的重要调节剂，与糖皮质激素受体（GR）、甲状腺激素受体（TR）和雌激素受体（ER）相互作用。此外，核小体组装蛋白、剪切相关蛋白以及多种转录因子等众多参与基因表达的蛋白都是颗粒酶A的底物。基于以上认识，可以推测如果肿瘤细胞中表达颗粒酶A，很可能通过对众多影响基因表达来调控底物的切割，从而影响肿瘤细胞基因表达的情况。

4.3 增强肿瘤细胞对细胞毒性作用的耐受性

肿瘤免疫编辑这一理论认为，免疫系统能够在某个阶段清除异常的转化细胞。颗粒酶A介导的细胞毒性作用能够靶向转化肿瘤细胞。肿瘤细胞中微量表达颗粒酶A可能有助于其对免疫细胞产生的细胞毒性作用的耐受，协助肿瘤细胞逃脱免疫监视，并且这一过程可能是通过肿瘤细胞提高颗粒酶A的蛋白酶抑制剂的表达量来实现的。有研究发现，肺癌细胞会通过表达蛋白酶抑制因子-9来保护其免受颗粒酶B介导的细胞毒作用，作为一种免疫逃避机制，这一功能随着肺癌分期的增加而增强[18]。

5 结语

以往认为颗粒酶由淋巴细胞产生，且所有种类颗粒酶主要是参与细胞毒性作用以及促炎作用，作为免疫细胞的子弹来杀伤靶细胞。基于颗粒酶B以及颗粒酶M肿瘤细胞中表达并影响肿瘤进程的研究，提出了肿瘤细胞可能表达微量颗粒酶A的观点。对现有颗粒酶A的研究进行了总结，提出肿瘤细胞中微量表达的颗粒酶A可能通过调控基因表达和对底物蛋白的切割影响肿瘤细胞的迁移、增强肿瘤细胞对细胞毒性作用的耐受性并影响肿瘤进程最终促进肿瘤逃逸。本文为今后颗粒酶A的研究提供了全新的思路，对于肿瘤中颗粒酶A作用和机制的研究也可为今后肿瘤的治疗提供新的观点和干预策略。