虾类主要过敏原及其检测技术的研究进展

左树娜，苑宁，徐慧，卢鑫，张伟，，3*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学理工学院，河北 沧州 061100；3.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071001）

食物过敏是一个引起世界范围广泛关注的健康问题[1]。世界卫生组织指出，全球约有30%～40%的人患过敏性疾病，且患病率呈逐年增长趋势，已成为全球六大慢性疾病之一[2-3]。联合国粮食及农业组织公布的引起过敏反应的食物中，90%是由牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类动物、花生、大豆、坚果和小麦引起的[4]。

虾、蟹等甲壳类动物是一种富含蛋白质的重要食物资源[5]，因其肉质鲜美而备受欢迎。但虾作为主要过敏原，其可能会引发消化系统紊乱（腹痛、腹泻）和皮肤刺激（皮炎、荨麻疹）或更严重的过敏症状（血管性水肿、休克、死亡）[6-8]。虾中主要致敏蛋白有原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（arginine kinase，AK）、肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）、肌质钙结合蛋白（sarcoplasmic calcium binding protein，SCP）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和血蓝蛋白（hemocyanin）等[9-10]。尽管烹饪可使虾中大部分致敏蛋白变性，但一些耐热蛋白依然存在致敏性[11]。此外生产、储存过程中发生的交叉污染也可能导致食物中存在虾过敏原[12-13]。因此为保障食用安全，除必要的标签标示之外[14]，对食品中虾过敏原成分的精准特异检测至关重要[15]。本文主要介绍虾过敏机制、5种主要致敏蛋白以及近几年虾过敏原的检测方法。

1 致敏机制

《日本儿科2016年食物过敏指南》（JPGFA 2016）对过敏反应进行了定义，“过敏反应是指接触特定食物后，通过抗原特异性免疫机制引起的不良反应[16]。”这些反应包括免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导和非IgE介导的过程[17]。

虾类过敏是IgE介导的I型超敏反应，其是由肥大细胞或嗜碱性粒细胞上抗原的特异性IgE交联导致的即时反应，一般在摄入食物20min～120min后出现过敏症状[18]。I型超敏反应具体反应机制为，当抗原（虾类致敏蛋白）进入过敏机体时，该抗原与其特异性IgE结合，在体内循环并与肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的Fc受体结合，使机体对抗原产生敏化。当同一抗原再次进入致敏体时，抗原与致敏细胞表面的特异IgE结合，使这些细胞释放一系列致敏介质，引起过敏反应[19]。

2 主要致敏蛋白

2.1 原肌球蛋白

TM是虾的主要过敏原，其是一种由100%α-螺旋纤维蛋白构成的螺旋状二聚体，分子量为34 ku～38 ku，起调节肌肉收缩的作用，广泛分布于真核细胞中[20-21]。研究发现TM具有较强的耐消化特性，这是由于其存在3个不被破坏的抗原表位和4个抗消化能力很强的抗原表位造成的[22]。Reese等[23]表征重组虾的致敏蛋白Pen a 1时，TM已经被定义为虾的主要过敏原且Pen a 1已被分离，对其研究最早可以追溯到1989年。在中国北方沿海地区，虾类过敏人群中对Pen a 1过敏者高达71.4%[24]。聂泽坤和GÁMEI等[25-26]从TM中分离出Mete1、Pen s 1、Lit v 1、Pen i 1、Hom a 1 等亚型[25-26]。甲壳类动物与螨虫和蟑螂之间的TM的氨基酸具有较高同源性，分别为78%～98%和80%～97%。

2.2 精氨酸激酶

AK是甲壳类动物的一种重要过敏原，分子量为40 ku，其致敏率高达70%，致敏性仅次于TM。但甲壳类动物与软体动物具有高度同源性，存在非常严重的交叉反应[27]。Yu等[28]确定Pen m 2为AK的一个新亚型，并在其中发现了特定的肌动蛋白结合结构域，推测Pen m 2可能具有调节或运输特性。在具有虾过敏病史或对虾提取物的ImmunoCAP呈阳性患者外周血单核细胞进行检测时，发现TH2细胞可识别Pen m 2，且其发挥着重要的致病作用[29]。基于此，2019年Gao等[30]提出了一种T细胞肽的免疫疗法（T cell peptide immunotherapy，PIT）以减轻虾过敏原AK诱导的食物过敏，这是一种无需IgE交联即可调节过敏反应的治疗策略，其最早被Wang等[31]提出治疗TM导致的过敏反应。

2.3 肌球蛋白轻链

MLC在2008年被认定是一种虾类过敏原，命名为Lit v 3.0101[32]，但目前对其过敏表位的研究较少。Yang等[33]对克氏原螯虾的肌球蛋白轻链亚型1（MLC1）进行了研究，得到了3个构象表位区域，为进一步的诊断或抗原研究提供了重要依据。

2.4 肌质钙结合蛋白

SCP是存在于无脊椎动物肌肉和神经组织中的EF-手型钙离子结合蛋白，主要参与肌肉的收缩，其亚型种类有 Pen m 4、Cra c 4、Lit v 4[34]。其中 Lit v 4.0101有194个氨基酸，分子量为22 ku，等电点为4.7。Ayuso等[35]研究表明，甲壳类动物、节肢动物和软体动物间均存在致敏成分TM，但SCP的致敏性似乎仅存在于甲壳类动物中。

2.5 丙酮酸激酶

PK是甲壳类动物中催化转化和转移反应重要的酶。2018年Lee等[36]分析了虾、蟹过敏患者的血清，发现了一个63 ku的致敏蛋白，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、 免 疫 印 迹（western blotting，WB） 和质谱法（mass spectrometry，MS）对其进行研究，并首次确定为一种新型的虾过敏原。

2.6 血蓝蛋白

血蓝蛋白是由6个高度螺旋异源亚基构成的六聚体，其分子量为72 ku或75 ku，具有良好热稳定性和耐胰液消化特性，不仅具有输氧、抗病毒、溶血等功能，而且在渗透压维持、免疫因子表达和能量转换等生理过程中具有一定的调控作用[37-40]。在西班牙和意大利，血蓝蛋白被认为是虾类致敏原之一，但在美国，其被认为是节肢动物和虾之间的交叉反应性致敏原[41]。

除以上6种主要的虾类过敏原以外，虾中还有肌钙蛋白（troponin C，TnC）[42-43]、磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，TIM）[44]等次要过敏原。

3 虾类过敏原的检测方法

3.1 免疫学方法

3.1.1 酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作为最典型的免疫学方法被广泛用于虾类过敏原的检测分析。

Kamemura等[19]使用ELISA和IgE交联诱导荧光素酶表达测定试验（IgE crosslinking-induced luciferase expression assay，EXiLE）方法证实了甲壳类和食用昆虫间存在着交叉过敏现象，以原肌球蛋白为发生交叉反应的主要过敏原。此研究表明对IgE抗体介导的食物过敏反应进行评估时，可能会因交叉反应而变得复杂。Yu等[45]开发了一种夹心ELISA检测加工食品中虾、蟹过敏原TM的方法，其检出限（limit of detection，LOD）为 6.8 ng/mL，定量限（limit of quantitation，LOQ）为13.67 ng/mL。李晓燕等[46]利用双抗体夹心ELISA法测定食物中虾过敏原成分，最低检出限为40 ng/mL，并且在40 ng/mL～1 000 ng/mL之间具有良好的线性关系。Zhang等[47]成功获得了特异性强、敏感性高的单克隆抗体CE7B2，利用夹心ELISA方法检测并定量了包括虾在内的16种无脊椎动物的TM，其中斑节虾（Marsupenaeus japonicus）的TM的检出限为0.09 ng/mL。

ELISA方法对于食品安全检测具有一定意义，但在检测深加工食品时，其致敏蛋白的一级结构被破坏易造成假阴性结果。

3.1.2 侧流免疫层析分析法

侧流免疫层析分析法（lateral flow immunoassay，LFIA）是近些年较常用的免疫学分析检测技术。其原理是基于竞争结合的方式，以硝酸纤维素膜为载体，通过在滤膜的检测线和控制线上固定不同成分，以捕获抗原与荧光物质-单克隆抗体的复合物，捕获后进行抗原-抗体反应，通过肉眼观察膜上的显色现象判定结果。

Wang等[48]建立了基于量子点的荧光侧流免疫层析分析法检测甲壳类动物中的TM，30 min内即可判定结果，肉眼可视化检出限为0.5 μg/mL，仪器监测荧光检出限为 0.05 μg/mL。

LFIA具有良好的特异性和重复性，但操作时要求加样精准，操作不当将产生假阴性或假阳性结果，在一定程度上限制了其广泛应用。

3.2 超高效液相色谱与质谱联用技术

质谱法（mass spectrometry，MS）是一种分子裂解后形成的离子按照其质量和电荷的比值（质荷比）大小依次排列成谱，从而记录数据的方法。近年来，在质谱仪器、分析软件和各种化学工具发展的推动下，MS得以快速发展[49]。MS已成为一种研究蛋白质组学的常用技术，其基于肽段进行定性或定量分析，可避免因加工处理样品时破坏蛋白质空间结构而影响检测结果，因此，MS检测过敏原时比其他基于蛋白质的方法更具优势，且提高了检测效率[50]。

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）是20世纪70年代在经典液相色谱和气相色谱的基础上，发展起来的一项高效灵敏的分离分析技术，可大大提高分离效率。近年来，基于液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）或高效液相色谱串联质谱（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的定量蛋白质组学方法被广泛应用于过敏原分析中，其为过敏原的检测提供了更为有力的分析策略[51]。

李紫薇等[52]使用超高效液相色谱-飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）对酶解后的南极磷虾（Euphausia superba）肽段进行了分离检测，并结合美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI） 蛋白数据库、Skyline生物信息学软件和三重四极杆质谱对酶解肽段进行验证，鉴定出南极磷虾中两种主要过敏原为TM和AK。Khanaruksombat等[53]使用LC-MS/MS结合SDSPAGE和WB对21例香蕉虾（Fenneropenaeus merguiensis）不同位置过敏的患者血清进行过敏原的测定，结果表明其肌肉和外壳中主要过敏原是AK，而卵巢中的主要过敏原是卵黄蛋白。

3.3 分子生物学方法

3.3.1 聚合酶链式反应及其衍生技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）作为最原始的分子检测技术，其应用范围甚广。随着人们生活水平的提高，对检测技术的要求越来越严苛，普通PCR已经无法满足人们的需求，以PCR为基础的一系列衍生技术应运而生，其中实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）为最常用的方法。

实时荧光PCR定量检测技术是在PCR的基础上结合探针或荧光染料，通过荧光信号强度的变化判定结果，是一种有效的定量工具。Fernandes等[54]建立了一种针对多品种虾类的实时荧光定量PCR系统检测虾类过敏原，并针对16S rRNA线粒体基因设计了特异性引物和探针。此方法可精准定量检测食品基质中的微量虾类过敏原，且有较高的灵敏度和较低的检出限。虾DNA的LOD为0.1 pg，虾与酱的二元混合物的LOQ可达0.000 1%。MÄDE等[55]选择线粒体16S rRNA基因作为检测食品中甲壳类动物的特异性基因，并设计了7对特异性引物和2组TaqMan探针，建立了实时荧光定量PCR系统，其LOD95%为约每个反应2.96个拷贝数。该研究着重强调了MgCl2和退火温度均可能影响实时荧光定量PCR反应的灵敏度。

除qPCR以外，近些年液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[56]、多重 PCR（multiplex PCR，MPCR）[57]也被广泛用于过敏原的检测。Suh等[58]利用多重PCR结合毛细管电泳法对包括凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）在内的8种海鲜（共5对特异性引物）的过敏原进行测定，凡纳滨对虾的LOD为0.016 ng。此方法可实现海鲜产品中多个致敏性软体动物同时且高效的检测，在加工食品中贝类过敏原的预防、标记和监测方面起到重要作用。

PCR及其衍生技术所需仪器均较昂贵且变温循环耗时长，限制了其广泛推广。

3.3.2 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种常用的DNA扩增技术，需4条～6条引物和Bst DNA聚合酶在60℃～65℃进行体外等温扩增。

Sheu等[59]利用LAMP方法实现了食品中虾类过敏原快速、灵敏的检测，此方法的LOD为0.01%，灵敏度为10-3ng，其灵敏度比PCR高100倍。

LAMP反应不需要昂贵的变温设备，但引物的设计和反应体系复杂，且引物间易相互作用，产生非特异性结果。

3.4 传感器

传感器作为一种新兴的技术，具有灵敏度高、特异性强、可以与其他技术和特殊材料结合的特点，该技术被广泛应用于各个领域。

3.4.1 表面等离子体共振

表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）是基于一种光学现象而建立的方法，即发生全反射产生的消逝波与介质中的等离子波共振，使反射光能量减弱，折射指数改变，从而对蛋白质定量。

Zhou等[60]利用表面等离子体共振传感器与金生物芯片定量检测了TM，其可以消除复杂贝类样品的基质干扰。该方法的LOD为1.0μg/mL，LOQ为2.5μg/mL。食品样品中TM的回收率为92.0%～108.0%，表明该方法具有较好的准确度。

SPR方法对生物分子无任何损伤，且不需任何标记物，响应速度较快。

3.4.2 适配体生物传感器

适体是通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）经体外筛选获得的一小段寡核苷酸序列或短的多肽，在传感器中可与相应的配体特异性结合，其亲和力高、特异性强[61]。

Chinnappan等[62]开发了一种与氧化石墨烯（graphene oxide，GO）联用的适配体生物传感器，30 min内可灵敏且特异地检测原肌球蛋白（TM）。该传感器使用荧光素染料标记单链适体，构建GO-适体复合物，通过GO的π堆积相互作用淬灭适体的荧光；而当TM存在时，适体会首先与TM结合，适体从GO表面脱离，荧光恢复。通过记录荧光强度的变化，检测食品中是否含有TM。此传感器使用较短的适体序列，提高了灵敏度，最低检测限为2 nmol/L，且具有较高回收率。

3.4.3 金纳米粒子生物传感器

金纳米粒子（gold nanoparticle，AuNP）是一种直径为1 nm～100 nm的纳米材料，其粒径不同则呈现不同的颜色。因其电子密度很高，常被用作电镜测试的标记物。

Wang等[63]开发了一种基于金纳米粒子的生物传感器，主要用于贝类过敏原原肌球蛋白（tromyosin，TROP）的定性和定量检测。通过检测TROP单克隆抗体、AuNPs和TROP的复合物的三向色性（circular dichroism，CD）信号变化判断结果。样品中游离抗原作为抑制剂，其越多则形成的复合物越少，CD信号越小，根据信号强度可直接判定检测结果。该生物传感器可在0.1 ng/mL～15 ng/mL选择性测定TROP，LOD为21 pg/mL，LOQ为70 pg/mL。此生物传感器具有较强的特异性和准确性，且样品制备简单，在检测贝类相关产品及其他的食物过敏原时具有良好适用性。

3.4.4 纳米磁珠生物传感器

近些年，纳米磁珠被广泛用于传感器技术的开发。传感器与纳米磁珠结合，其灵敏度大大提高，检出限有所降低，操作也变得简单易懂，具有潜在的应用价值。

Zhang等[64]采用基于磁纳米颗粒的荧光分析法对食品基质中过敏原TM进行检测。此传感器将功能化磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNPs）作为分离载体，以OliGreen染料作为信号探针，可以与单链DNA特异结合，发出强烈的荧光信号。当TM存在时，TM与适体结合，导致适体-MNPs复合物构象发生变化，适体被释放到上清液中。加入OliGreen染料后，其与上清液中的适体结合，荧光信号增强超过1 000倍。该方法检测食品中TM的LOD为77 ng/mL。

3.4.5 荧光磁珠细胞传感器

Jiang等[65]开发了基于荧光磁珠的新型电化学细胞传感器，通过产生的特定电化学信号准确检测和评估食品基质中各种过敏原，其中虾过敏原Pen a 1的检出限为0.03 μg/mL。与2013年该团队开发的细胞传感器相比[66]，该传感器检测更灵敏，其检出限降低了一个数量级。

电化学传感器可与免疫学方法、分子生物学方法和细胞检测相结合，实现食品中过敏物质的高效、灵敏检测。这些技术的开发和应用可在一定程度上提高食品安全监控的力度[67]。

4 展望

虾类物质引起的食物过敏随着人们对虾需求量的不断增加而呈现持续上升的趋势，对虾致敏蛋白和检测技术的深入研究至关重要。今后应持续发掘虾类新的过敏原以及加深对过敏原的研究，拓宽对现有过敏原的认知度。另一方面，应综合现有检测方法的优势，开发更加低廉、便捷、高效、强特异性、高灵敏度的先进检测技术和微型化、智能化的检测设备，以实现高通量现场检测，降低食物过敏的风险，最大程度保障过敏患者的安全健康。